SCH66336對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制

劉安玲，鄭 航

(1南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究學(xué)院，廣州510515;2南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院)

最近研究發(fā)現(xiàn)，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTIs)可通過抑制促癌蛋白Ras的活性及細(xì)胞內(nèi)其他靶分子，在多種腫瘤的治療中有效［1］。但其對胃癌細(xì)胞的影響鮮見報道。2008年10月～2009年10月，我們觀察了FTIs SCH66336(以下簡稱SCH)對胃癌細(xì)胞SGC-7901與MGC-803增殖、凋亡的影響，現(xiàn)探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SCH購自Schering Plough Inc.(Kenilworth，NJ，U.S.A)，以 DMSO 溶解。DMEM 培養(yǎng)基(含超級新生小牛血清)購自Gibco公司。Phospho-S6(S235/236)、活化的 Caspase-3、細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)抗體購自Cell Signaling Technology;四氮唑藍(lán)(MTT)是AMRESO產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。人胃癌細(xì)胞株SGC-7901與MGC-803購自上海細(xì)胞庫。CO2培養(yǎng)箱;流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 用DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.2.2 SCH干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測 取對數(shù)生長期SGC-7901及MGC-803細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/ml，接種于96孔板中，12 h后分為兩組，實(shí)驗(yàn)組加入SCH使終摩爾濃度分別為0.1、0.3、1.0、3.0 μM，陰性對照組加入等體積含DMSO的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)36、72 h。按 MTT法測得A值，重復(fù)6次。計算腫瘤細(xì)胞生長抑制率(IR)，IR=［(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組］×100%。

1.2.3 SCH干預(yù)及細(xì)胞周期與凋亡率檢測 將SGC-7901與MGC-803細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)。測定細(xì)胞周期時，按1.2.4處理方法加入SCH，48 h后收獲細(xì)胞;測定細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，SCH處理24 h后收獲細(xì)胞。染色后流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，計算凋亡率。

1.2.5 SCH干預(yù)及S6磷酸化(S235/236)、cyclin D1與Caspase-3表達(dá)測定 參照文獻(xiàn)［2］，胃癌SGC-7901、MGC-803細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分別加入終濃度為 0.1、0.3、1.0、3.0 μM 的 SCH 處理細(xì)胞 24 h后，Western blot法檢測 S235/236、Caspase-3、cyclin D1表達(dá)，并用Band Leade軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 11.2統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，行單因子方差分析處理，組間比較采用Dunnett方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SCH作用后胃癌細(xì)胞的生長抑制率 見表1。

2.2 SCH作用后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期 見表2。

2.3 SCH作用24 h后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率 見表3。

2.4 SCH作用后胃癌細(xì)胞S235/236、cyclin D1與caspase-3表達(dá) 見表4。

3 討論

表1 不同濃度SCH作用36、72 h后胃癌細(xì)胞的生長抑制率(%，±s)

表1 不同濃度SCH作用36、72 h后胃癌細(xì)胞的生長抑制率(%，±s)

注:與0.1 μM 比較，*P ＜0.05;與 0.3 μM 比較，△P ＜0.05;與 1.0 μM比較，#P＜0.05

SGC-7901MGC-803組別 細(xì)胞 細(xì)胞36 h 72 h 36 h 72 h實(shí)驗(yàn)組0.1 μM 28.41±4.01 46.13±3.12 24.47±2.34 39.88±2.36 0.3 μM 42.69±2.55* 66.15±3.44* 35.33±3.46* 58.98±4.67*1.0 μM 63.45±3.12＊△ 79.22±4.46＊△ 55.36±5.52＊△ 73.05±6.64＊△3.0 μM 73.41±3.67＊△#88.11±5.38＊△# 70.24±4.96＊△#85.12±6.41＊△#對照組0000

研究證實(shí)，Ras蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)是Ras蛋白加工過程中最重要的催化酶之一［3］。FTIs能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，同時對正常細(xì)胞無明顯毒性［1］，是一類新的信號傳導(dǎo)抑制劑，對甲狀腺癌、胰腺癌、肺癌、腸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用［1］。SCH是一個三環(huán)非肽類的FTIs，可與CAAX底物競爭FTase。本研究發(fā)現(xiàn)，SCH作用于胃癌細(xì)胞系SGC-7901與MGC-803后，呈時間與劑量依賴地抑制細(xì)胞的增殖，使這些細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期。在低血清(0.1%)條件下，可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡;即SCH在體外對胃癌細(xì)胞有顯著抑制作用。

表2 SCH作用48 h后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期改變(%，±s)

表2 SCH作用48 h后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期改變(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與0.1 μM 比較，△P ＜0.05;與0.3 μM 比較，#P ＜0.05;與1.0 μM比較，▲P ＜0.05

組別 SGC-7901細(xì)胞G0/G1 S G2/M細(xì)胞G0/G1 S G2 MGC-803/M實(shí)驗(yàn)組0.1 μM 51.63±2.13* 36.71±1.15* 11.66±0.29 57.46±2.36* 28.32±1.27* 14.22±0.63 0.3 μM 57.02±2.74＊△ 27.51±1.28＊△ 15.47±0.54 58.81±2.78＊△ 30.41±1.12＊△ 10.78±0.46 1.0 μM 64.23±2.98＊△# 22.75±1.08＊△# 13.02±0.25 65.61±3.29＊△# 25.94±1.26＊△# 8.45±0.37 3.0 μM 65.21±3.12＊△#▲ 23.37±1.14＊△#▲ 11.42 ±0.47 68.33 ±3.21＊△#▲ 18.76±0.87＊△#▲ 12.91±0.55對照組 40.58±1.99 45.26±2.25 14.16±0.62 48.18±2.31 40.87±1.74 10.95±0.48

表3 SCH作用24 h后對胃癌細(xì)胞凋亡率(%)

表4 SCH作用48 h后胃癌細(xì)胞S235/236、cyclin D1與caspase-3表達(dá)(±s)

表4 SCH作用48 h后胃癌細(xì)胞S235/236、cyclin D1與caspase-3表達(dá)(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與0.1 μM 比較，△P ＜0.05;與0.3 μM 比較，#P ＜0.05;與1.0 μM 比較，▲P ＜0.05

組別 SGC-7901細(xì)胞MGC-803細(xì)胞S235/236 cyclin D1 Caspase 3S235/236 cyclin D1 Caspase 3實(shí)驗(yàn)組0.1 μM 104.26±8.99* 74.27±5.05* 34.22±3.66* 65.48±6.37* 56.60±3.90* 25.77±2.80*0.3 μM 79.45±7.80＊△ 68.34±7.45＊△ 50.90±6.77＊△ 58.87±5.71＊△ 51.07±5.47＊△ 46.25±3.82＊△1.0 μM 63.12±5.78＊△# 46.78±3.21＊△# 77.35±3.05＊△# 48.07±3.20＊△# 35.76±5.68＊△# 68.04±3.56＊△#3.0 μM 43.33±6.55＊△#▲ 35.66±3.56＊△#▲ 89.46±7.12＊△#▲ 39.05 ±1.78＊△#▲ 24.87±1.33＊△#▲ 98.58±6.78＊△#▲對照組 142.23±10.48 96.38±6.04 7.33±0.55 100.56±6.89 76.34±4.77 8.33±0.89

對于FTIs的作用機(jī)理，目前認(rèn)為其作用靶點(diǎn)除Ras外，還具有不依賴Ras的活性。其對缺乏Ras突變的某些腫瘤治療有效，如對Ras突變率很低(不足2%)的乳腺癌有效［4］。這可能基于FTIs對與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)的其他異戊烯化蛋白有作用。這類FTIs靶點(diǎn)蛋白有些已被證實(shí)，如核纖層蛋白 A(laminA)、小分子 GTPase Rho 以及 Rheb［5，6］。其中Rheb是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的上游活化分子，是細(xì)胞生長增殖的中心調(diào)控分子，可接受細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激如激素、生長因子、營養(yǎng)等調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞生長增殖、存活等生理過程;而很多腫瘤的發(fā)生涉及mTOR信號的過度激活［7］。mTOR被Rheb激活后磷酸化S6激酶1(S6K1)，后者磷酸化S6(S235/236)促進(jìn)核糖體的發(fā)生及cyclin D1等蛋白質(zhì)的翻譯，以及細(xì)胞的生長增殖［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，SCH能下調(diào)胃癌細(xì)胞S235/236及cyclin D1表達(dá)，這與其引起胃癌細(xì)胞G0/G1期阻滯及抑制增殖的作用是一致的。此外，SCH還具有誘導(dǎo)活化的Caspase-3表達(dá)及胃癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，SCH對胃癌細(xì)胞有明顯抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用。機(jī)制可能為抑制Rheb/mTOR/S6信號，降低cyclin D1表達(dá)及誘導(dǎo)Caspase-3活化。

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