高原低氧應激誘導大鼠海馬CA1區神經元凋亡及其機制

吳 穹，郭志堅，馬祁生*

(1青海大學醫學院病理生理教研室，西寧810001;2青海交通醫院)

機體對低氧應激反應異常是導致各種高原適應不全和急性高原病的重要原因。海馬是邊緣系統的重要組成部分，是介導應激反應的最重要的腦區之一。研究表明，應激反應可抑制海馬齒狀回顆粒細胞增殖，導致海馬神經元細胞丟失、樹突萎縮等［1］。為探討高原低氧應激對海馬神經元凋亡的影響及機制，2007年8月～2009年10月我們進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 Leica EM UC6rt型超薄切片機，日立H-7500透射電鏡，FACS420型流式細胞儀，LD4-2A離心機;溴化乙啶(EB)染液(含EB 2 ml，RAN酶2 mg，枸櫞酸鈉200 ml，生理鹽水130 ml，雙蒸水70 ml，Triton-X100 2 ml)、RNA 酶、Triton-X100 均購于Sigma公司，羊抗大鼠COX-2多克隆抗體由Santa Cruz公司生產，SOD、MDA測試盒、考馬斯亮藍試劑盒、免疫組織化學試劑盒及顯色劑DAB均購于北京中山公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠48只，體質量(280±20)g，隨機分為低海拔組和高海拔組各24只。低海拔組于海拔400 m(陜西西安)處飼養，高海拔組從陜西西安運至海拔4 300 m的青海果洛花石峽縣飼養。飼養期間均籠裝喂養，隨意進食和飲水，光照時間8∶00～17∶00。兩組均飼養30 d。

1.2.2 相關指標測定 ①海馬組織結構形態:兩組各取6只快速斷頭取腦，冠狀切取位于視交叉后1～4 mm處的腦組織，于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，石蠟包埋、切片(5 μm厚)，組織切片行硫堇染色，光學顯微鏡下觀片。將海馬從剩余腦組織剝離，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊。于4%戊二醛固定4 h，PBS緩沖液清洗，1%鋨酸二次固定1.5 h，梯度丙酮脫水，Epon812環氧樹脂浸泡、包埋、聚合，超薄切片機切片，片厚50～70 nm，電鏡觀察。②海馬神經元凋亡率:兩組各取6只快速斷頭取腦，分離雙側海馬，用4℃預冷的生理鹽水沖洗紅細胞后置于4℃預冷的70%乙醇中固定，4℃保存待用。將固定好的海馬組織剪碎，在120目不銹鋼網上用眼科鑷子輕輕揉搓，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完。將收集的混懸液用300目尼龍網過濾，收集細胞懸液，500～800 r/min離心2 min。取單細胞懸液0.1 ml(含1×105個細胞)，加入 EB染液1 ml，4℃避光條件下進行DNA染色30 min，流式細胞儀進行單參數檢測，檢測前以雞紅細胞作為標準樣品，調整儀器的變異系數(CV)在5%以內，測量數據輸入 HP-Consort30計算機，應用 Single histogram statistics軟件進行處理并打印出結果。由于凋亡細胞DNA發生有序降解，被降解的相對低分子質量DNA片段從變性細胞膜漏出細胞外，使得凋亡細胞內的DNA含量減低，在流式細胞儀測定細胞DNA含量直方圖中G1峰前出現一個亞二倍體峰，即凋亡峰。測凋亡峰的百分率及凋亡率。③海馬組織丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定:兩組各取6只，斷頭取腦組織于冰盤上分離出海馬，用冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙試干，稱重，放入10 ml的小燒杯內。用帶刻度的滴管取預冷的生理鹽水(總量為組織塊重量的9倍)。用普通移液管移取少量于小燒杯中，用眼科小剪子盡快剪碎組織塊。將剪碎的組織和冷生理鹽水一起倒入勻漿管中，研磨制成10%的組織勻漿(操作過程中，小燒杯及勻漿管下端均處于冰水浴中)。將勻漿用低溫離心機在4℃條件下3 500 r/min離心15 min。取適量上清液，采用硫代巴比妥酸法測定CA1區MDA水平、黃嘌呤氧化酶法測定SOD性;用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。以上測定均嚴格按照試劑盒說明書操作。④環氧合酶(COX)-2表達:兩組各取6只快速斷頭取腦，腦組織取材、固定、包埋、切片同硫堇染色。每例隨機選取CA1區5張切片，免疫組化法于光學顯微鏡下進行定性觀察，計數COX-2陽性細胞。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件。計量數據均以±s表示。采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 海馬CA1區組織結構 硫堇染色顯示低海拔組海馬CA1區組織結構清晰，錐體細胞分布均勻、排列整齊，4層以上，核大而圓，無異常;高海拔組海馬CA1區組織形態與對照組基本一致，但出現個別錐體細胞水腫及細胞間隙增寬的現象。電鏡觀察示低海拔組CA1區錐體細胞結構正常，細胞核圓或橢圓，無增大，細胞器豐富。高海拔組CA1區錐體細胞體積增大，胞質豐富，胞質內空泡形成，核增大，核仁清楚，線粒體腫脹，數量減少。

2.2 海馬神經元凋亡率、海馬組織MDA含量、SOD水平及COX-2的表達 見表1。

表1 兩組海馬神經元凋亡率、海馬組織MDA水平、SOD 活性及 COX-2 表達(n=24，±s)

表1 兩組海馬神經元凋亡率、海馬組織MDA水平、SOD 活性及 COX-2 表達(n=24，±s)

注:與低海撥組比較，*P＜0.05

組別 神經元凋亡率(%)MDA水平(μmol/g)SOD活性(103U/g)COX-2陽性細胞(個/mm2)高海拔組 5.86±0.42* 6.845±0.236* 82.525±4.307 20.13±3.22*低海拔組 2.54±0.58 3.904±0.198 83.697±4.320 12.10±2.12

3 討論

高原低氧對中樞神經系統的影響是一個極為復雜的過程，可通過多種機制影響機體學習記憶等高級功能。海馬與學習、記憶、行為、情緒密切相關 ，也是應激損傷的主要靶器官。研究發現，高原低氧會導致大鼠海馬部分神經細胞血—腦屏障足突腫脹，細胞質內出現空泡，提示有凋亡現象出現，高原低氧降低大鼠學習記憶能力不僅具有時間依賴性，而且呈高度依賴形式［2］。

本研究硫堇染色顯示兩組CA1區組織形態基本一致，但出現個別錐體細胞水腫及細胞間隙增寬現象，說明高原并未對大鼠海馬神經元造成顯著損傷。但通過電鏡觀察發現，高海拔組海馬CA1區神經細胞體積增大，胞質增多，胞質形成空泡;細胞核增大，線粒體膨脹，數量減少。線粒體是細胞的能量代謝中心，又是氧自由基產生的主要部位，線粒體被認為在細胞缺氧中具有重要作用，本研究高海拔組海馬神經元凋亡率明顯高于低海拔組，提示高原低氧應激誘導了海馬神經元凋亡。

目前認為，在卒中、腦損傷以及各種神經變性性疾病中，氧化應激反應是神經元凋亡的重要機制。上述疾病病理生理變化中一個共同的特征是興奮性毒性引起的氧化應激。細胞興奮性毒性是由于興奮性毒性氨基酸受體介導的鈣離子濃度增高導致線粒體損傷，從而引起氧自由基產物增高［3～5］。自由基一方面可引起線粒體結構和功能受損，影響丙酮酸脫氫酶的活性，使葡萄糖的氧化分解發生障礙，乙酰膽堿合成不足，導致學習、記憶功能呈漸進性減退;另一方面可損傷線粒體DNA(mtDNA)，導致其編碼的呼吸鏈復合物酶蛋白亞基表達下降，酶活性降低，進一步危害能量代謝機制。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的穩定代謝產物，SOD是體內天然的抗氧化物，能清除自由基而具有抗自由基損傷作用，MDA及SOD水平能間接反映腦組織中氧自由基水平和脂質過氧化反應。本研究發現平原大鼠在高海拔地區喂養后MDA含量升高，表明機體發生了氧化應激反應，導致脂質過氧化作用增強，而且機體清除自由基的能力下降。高海拔組SOD活性與對照組無顯著差異，其可能原因是長期、嚴重的低氧刺激可嚴重破壞細胞的結構或細胞器結構，特別是線粒體結構。

COX是催化花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PG)以及血栓素的限速酶，其活性對控制前列腺素類物質的合成有重要作用。COX分為結構型(COX-1)及誘導型(COX-2)。文獻報道，COX-2可能是腦缺血后氧自由基產生的主要機制。生理情況下，血管內皮細胞內有少量COX-2表達，已有實驗證實，缺氧可誘導血管內皮細胞內COX-2表達。本研究高海拔組CA1區COX-2明顯高于低海拔組，依據COX-2于高原低氧應激后的明顯表現，有理由推測高原低氧應激可能通過COX-2過表達造成線粒體損傷，從而誘導海馬神經元凋亡。

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