組織因子對奧沙利鉑抑制人胃癌細胞侵襲及誘導其凋亡的影響

郭 超,曹 農(nóng),俞永江,柴 琛,馬海濤,李 強

(蘭州大學第一醫(yī)院,蘭州 730000)

奧沙利鉑是胃癌化療的常用藥,其作用機制為抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移、誘導腫瘤細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),組織因子(TF)與腫瘤的侵襲及轉移有關。2009年 5～12月,我們采用成功轉染 TF-pcDNA3及空載體 pcDNA3的人胃癌細胞 SGC7901與奧沙利鉑共同孵育,觀察 TF對奧沙利鉑抑制SGC7901細胞侵襲及誘導其凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 成功轉染 TF-pcDNA3及 pcDNA3的SGC7901,Transwell小室,Matrigel,Caspase-3活性檢測試劑盒,Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒,奧沙利鉑。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與培養(yǎng) 將成功轉染 TF-pcDNA3的 SGC7901作為實驗組,轉染 pcDNA3的 SGC7901作為對照組,均培養(yǎng)在含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基,置 37℃、5%CO2細胞孵育箱內。

1.2.2 細胞侵襲力觀察 Transwell小室、細胞懸液的制備按說明書進行。將 Transwell小室放入 24孔板,取兩組細胞懸液加入 Transwell小室,與奧沙利鉑 10μg/ml共同孵育 24 h。檢測 Transwell小室聚酯膜下表面的遷移細胞數(shù),即高倍鏡(×200)下隨機取 4個視野,計數(shù)細胞核個數(shù),取平均數(shù),實驗重復 3次。

1.2.3 Caspase-3活性及細胞凋亡率檢測 將實驗組和對照組細胞均以1×106/孔接種于6孔板,分別與 10、20、30、40 μg/ml奧沙利鉑共同孵育 4、8、16、24 h。采用比色法檢測 Caspase-3活性,以波長 405 nm處的吸光度值表示；Annexin-V/PI雙染色法測算細胞凋亡率。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較用 t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞侵襲力比較 實驗組 Transwell小室底部聚酯膜表面細胞核數(shù)目為(38.7±3.6)個,多于對照組的(32.3±2.1)個,P＜0.05。

2.2 兩組細胞 Caspase-3活性及細胞凋亡率比較見表1、2。

表1 兩組細胞 Caspase-3吸光度值比較(±s)

表1 兩組細胞 Caspase-3吸光度值比較(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 Caspase-3 4 h 8 h 16 h 24h實驗組10μg/ml 0.036±0.002*0.042±0.003*0.059±0.005*0.072±0.004*20μg/ml 0.048±0.004*0.056±0.003*0.077±0.004*0.099±0.008*30μg/ml 0.057±0.004*0.065±0.003*0.091±0.009*0.130±0.010*40μg/ml 0.065±0.007*0.090±0.009*0.151±0.011*0.207±0.011*對照組10μg/ml 0.043±0.003 0.055±0.005 0.072±0.005 0.091±0.009 20μg/ml 0.057±0.003 0.068±0.006 0.089±0.005 0.122±0.005 30μg/ml 0.064±0.002 0.077±0.004 0.123±0.009 0.160±0.012 40μg/ml 0.076±0.006 0.116±0.011 0.168±0.012 0.286±0.012

表2 兩組細胞凋亡率比較(%,±s)

表2 兩組細胞凋亡率比較(%,±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01

組別 細胞凋亡率4 h 8 h 16 h 24h實驗組10μg/ml 1.01±0.30*1.78±0.29*2.72±0.45*3.56±0.23#20μg/ml 2.14±0.49*3.54±0.70*5.21±0.69#8.13±0.89#30μg/ml 4.04±0.52*5.81±0.41*7.31±0.78*15.20±1.20#40μg/ml 6.93±0.71*8.67±0.66*13.40±1.32#22.77±1.95#對照組10μg/ml 1.74±0.31 2.65±0.38 3.93±0.58 5.57±0.65 20μg/ml 3.85±0.68 5.95±1.07 8.81±0.98 14.52±1.41 30μg/ml 5.32±0.55 7.05±0.62 10.33±1.09 21.10±1.00 40μg/ml 8.03±0.90 11.03±1.36 16.90±1.59 28.00±2.41

3 討論

研究表明,TF不僅在人體正常細胞廣泛表達,在多種腫瘤細胞也高表達,并表現(xiàn)出許多非凝血功能。Poon等[1]通過對手術切除肝癌標本行免疫組化研究發(fā)現(xiàn),TF與肝癌血管生成、侵襲、轉移及患者預后明顯相關。Takano等[2]研究認為,TF是一種膠質細胞瘤血管生成的調節(jié)因子,在惡性程度較高的膠質細胞瘤細胞及新生血管內皮細胞中呈高表達。

本研究發(fā)現(xiàn),轉入 TF-pcDNA3的 SGC7901細胞較轉入 pcDNA3的 SGC7901細胞遷移數(shù)明顯增高,而 caspase-3活性及細胞凋亡率降低,提示 TF通過細胞凋亡、細胞侵襲途徑對奧沙利鉑的體外化療作用產(chǎn)生影響,從而降低其療效,影響胃癌患者的預后。TF在化療過程中產(chǎn)生影響的機制并未完全闡明。Camere等采用基因芯片法篩查人角質細胞 TF與 FⅦa結合前后基因表達譜的改變,發(fā)現(xiàn)包括 cfos、EGF、IL-1等 24種基因上調,而上述細胞因子或癌基因的激活可促進腫瘤細胞的侵襲和上調 MMPs表達,MMPs能使腫瘤細胞周圍基質降解,從而參與腫瘤細胞侵襲的調控[3]。有研究表明,TF/FⅦa復合物能通過激活 PI3K/Akt信號轉導抑制去血清誘導的幼倉鼠腎細胞凋亡[4,5],提示 TF可能是通過與FⅦa形成 TF/FⅦa復合物,進而激活信號轉導對腫瘤細胞凋亡、侵襲產(chǎn)生影響。高表達的 TF可使腫瘤組織局部形成高凝環(huán)境,高凝環(huán)境中大量纖維蛋白及瘤栓形成,可將腫瘤細胞與不利于其存活的環(huán)境隔離,使其躲避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視并免受抗腫瘤藥物的攻擊[6]。腫瘤細胞可能通過 TF活化凝血途徑產(chǎn)生的凝血酶起到降解、改變細胞外基質的作用[7],從而易于存活、增殖、黏附、侵襲以及轉移。我們認為,TF可以降低奧沙利鉑對人胃癌細胞侵襲力的抑制作用,減弱奧沙利鉑誘導的凋亡,可能影響腫瘤的轉歸及預后。有關 TF產(chǎn)生上述作用的詳細機制,有待進一步深入研究。

[1]Poon RT,Lau CP,Ho JW,et al.Tissue factor expression correlates with tumor angiogenesis and invasiveness in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(14):5339-5345.

[2]Takano S,Tsuboi K,Tomono Y,et al.Tissue factor,osteopontin,alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomas associated with vascular endothelial growth factor expression[J].Br J Cancer,2000,82(12):1967-1973.

[3]Camerer E,Rottingen JA,Gjernes E,et al.Coagulation factors VIIa and Xa induce cell signaling leading to up-regulation of the egr-1 gene[J].J Biol Chem,1999,274(45):32225-32233.

[4]Sorensen BB,Rao LV,Tornehave D,et al.Antiapoptotic effect of coagulation factorⅦa[J].Blood,2003,102(5):1708-1715.

[5]Versteeg HH,Spek CA,Richel DJ,et al.Coagulation factorsⅦa andⅩa inhibit apoptosis and anoikis[J].Oncogene,2004,23(2):410-417.

[6]Lykke J,Nielsen HJ.The role of tissue factor in colorectal cancer[J].Eur J Surg Oncol,2003,29(5):417-422.

[7]張劍權,萬遠廉.組織因子促進腫瘤侵襲及轉移的研究進展[J].中華實驗外科雜志,2007,24(3):382-384.