PPARγ配體對人肺癌細胞 95-D增殖的影響及機制探討

于鵬飛,曾波航

(廣州醫學院,廣東廣州 510182)

過氧化物酶體增殖體激活受體 γ(PPARγ)是一類由配體激活的核轉錄因子,為核激素受體超家族中的成員。研究表明,這些配體對多種人類腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡具有調節作用。2000年 7月～2007年 7月,我們觀察了 PPARγ合成配體曲格列酮(TGZ)和天然配體 15-脫氧前列腺素 J2(15-PGJ2)對高轉移肺腺癌細胞株 95-D細胞增殖、凋亡、分化及其對 PPARγ表達水平的影響,研究PPARγ通路與細胞增殖和凋亡之間的關系,探討PPARγ作為肺癌診療的新靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 95-D細胞,15-PGJ2,TGZ,山羊抗人PPARγ,即用型 SABC免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒,Annexin V/PI kit,RPMI-1640細胞培養基,胎牛血清,DMSO。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將 95-D細胞在含 10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml的 RPMI-1640培養基中培養,在 37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中貼壁培養,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞增殖活性檢測 采用 MTT法。取對數生長期 95-D細胞并調整至 5×104/ml,接種 96孔板,每孔 150μl,另設空白組。每孔加入 200μl培養液,37℃、5%CO2培養 48 h。TGZ組加入 TGZ溶液 50μl(終濃度 40μmol/L),15-PGJ2組加入 15-PGJ2溶液 50μl(終濃度 20μmol/L),對照組加入DMSO混合溶液 50μl(DMSO∶10%FBSRPMI-1640為 1∶19,下同 ),繼續培養 12、24、36 h。每孔加入0.5%MTT溶液 20μl培養 4 h,棄上清。每孔加200μl DMSO,振蕩 10 min,使結晶充分溶解。采用酶聯免疫檢測儀測定各孔 OD值,測定波長490 nm,參考波長 630 nm。細胞增殖抑制率 =(1-實驗組OD值 /對照組 OD值)×100%。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞儀檢測。取對數生長期細胞,分為 TGZ組、15-PGJ2組、對照組,分別加入 500μl的 TGZ溶液、15-PGJ2溶液、DMSO混合溶液,終濃度同上,培養 12 h。用 0.25%胰蛋白酶消化細胞,800 r/min離心 5 min,棄上清。用預冷的 PBS液洗滌 1次,離心棄上清。用已稀釋的冰凍 buffer重懸細胞,調細胞濃度為 106個/ml,加 5μl Annexin V和 5μl PI溶液于 490μl的細胞懸液中,輕柔混勻,4℃避光孵育 10 min。凋亡細胞染色呈棕黃色。上機檢測細胞凋亡率。

1.2.4 細胞周期檢測 采用流式細胞儀檢測。分組用藥同上,培養 24 h。用 0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液消化細胞,輕輕吹成懸液,調細胞濃度為 1×106/ml。800 r/min離心 5 min,棄上清。后用預冷的 PBS液洗滌 1次,離心去 PBS。加入冰預冷的 70%乙醇固定,4℃ 2 h。離心棄去固定液,PBS重懸 5 min。400目篩網過濾 1次,800 r/min離心 5 min,棄去 PBS。每管加入 1 ml PI染液,4℃冰箱孵育 30 min。離心洗去 PI染液,加 1 ml PBS重懸,上機檢測,結果采用 ModFit軟件分析。

1.2.5 PPARγ表達檢測 采用免疫細胞化學法。取對數生長期細胞,用胰酶消化并吹打成細胞懸液,調整細胞濃度 5×104/ml。接種至含載玻片的 6孔板內,每孔 2 ml,置于 37℃、5%CO2細胞培養箱內48 h。TGZ組、15-PGJ2組、對照組分別加入 250μl的 TGZ溶液、15-PGJ2溶液、DMSO混合溶液,終濃度同上,培養 24 h。采用 ABC法染色,嚴格按說明書操作,以細胞染成棕黃色為陽性。每組隨機選擇20個高倍視野,計算陽性細胞占細胞總數的百分比。

1.2.6 統計學方法 采用 SPSS13.0軟件分析。細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、細胞周期的比較采用SNK-q檢驗；PPARγ表達水平的比較采用 Kruskal-Wallis檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 見表1。由表1可見,TGZ、15-PGJ2組作用 12、24、36 h,對 95-D細胞的抑制率依次提高,且兩兩比較,P均 ＜0.01。

2.2 各組細胞凋亡率比較 TGZ組細胞凋亡率為26.36%±2.92%,15d-PGJ2組為 38.04% ±3.25%,對照組為 1.41%±0.57%,TGZ組、15-PGJ2組與對照組比較,P均 ＜0.01,TGZ組和 15-PGJ2組比較,P＜0.05。

2.3 細胞周期檢測結果比較 見表2。

表1 各組細胞增殖抑制率比較(%,±s)

表1 各組細胞增殖抑制率比較(%,±s)

組別 細胞增殖抑制率12 h 24 h 36 h TGZ組 36.17±1.18 55.48±1.49 93.47±4.30 15-PGJ2組 49.67±1.19 65.29±1.84 97.21±1.41

表2 各組細胞周期檢測結果比較(%,±s)

表2 各組細胞周期檢測結果比較(%,±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01與 TGZ組比較,#P＜0.01

對照組 73.57±3.82 21.34±3.22 5.09±0.80 TGZ組 53.87±5.71* 44.32±6.75* 1.81±1.07*15-PGJ2組 27.33±3.72*#73.67±3.72*#0.02±0.01*#

2.4 各組 PPARγ表達比較 TGZ組 PPARγ陽性細胞百分比為 58.25%,15-PGJ2為59.80%,對照組為 0.60%。TGZ組和 15-PGJ2組與對照組比較,P均 ＜0.01。

3 討論

PPAR是一組核激素受體超家族,包括 PPARα、PPARβ、PPARγ3種亞型,其中 PPARγ與腫瘤發生、發展關系最密切。PPARγ具有 DNA結合區、配體結合區、N-末端 3個結構域,其中 N-末端與細胞分化有關。PPARγ是目前研究最多的一個亞型,根據N-末端不同分為 PPARγ1、2、3亞型。研究表明,PPARγ與調節細胞分化和細胞增殖有關,因此眾多研究者探索 PPARγ配體作為腫瘤靶向治療藥物的可能性[1,2]。

本研究選擇高轉移肺腺癌細胞株 95-D,同時用激活作用較強的 PPARγ合成配體 TGZ和天然配體15-PGJ2激活 PPARγ,觀察 PPARγ配體對 95-D細胞的增殖和凋亡作用。在國內外研究中,15-PGJ2濃度多用 10～30μmol/L,TGZ多用 20～50μmol/L。Chacko等[3]認為,15-PGJ2和 TGZ最適濃度分別為 20μmol/L和 40～50μmol/L,最適作用時間為24 h,此時 15-PGJ2和 TGZ對細胞增殖的抑制及細胞凋亡的誘導作用較顯著。本研究中 15-PGJ2和TGZ的濃度分別為 20、40μmol/L,結果顯示,TGZ和 15-PGJ2對 95-D細胞的抑制率與藥物作用時間有關,隨作用時間延長,藥物對 95-D細胞增殖的抑制作用明顯增強。

腫瘤是一類細胞增殖周期紊亂性疾病,即細胞凋亡失控的疾病,細胞周期的調控在腫瘤的發生和治療中起重要作用。作用 24 h時,TGZ和 15-PGJ2能明顯誘導 95-D細胞凋亡。有研究表明,PPARγ激活后可調節 Cyclin D1、Cyclin B1及 cdc2、cdc4、cdc25蛋白表達,從而使細胞停滯在 G1期,S期細胞減少,導致腫瘤細胞發生凋亡和分化[4]。本研究中,PPARγ配體 15-PGJ2和 TGZ作用于 95-D細胞24 h后,S期細胞比例較對照組顯著增加,而 G1期細胞比例則減少。PPARγ配體誘導 95-D細胞停滯于 S期,使之無法完成有絲分裂,從而抑制 95-D細胞的增殖活性,促進其發生凋亡。本研究結果與其他研究結論有差異,可能與組織異質性等有關。本研究結果顯示,PPARγ配體能顯著提高 PPARγ表達,從而進一步發揮 PPARγ調節細胞增殖、分化及誘導細胞凋亡的功能。

綜上所述,PPARγ配體能有效激活 PPARγ,提高 PPARγ在肺癌 95-D細胞中的表達,而高表達的PPARγ可能通過各種方式從而調節 95-D細胞分化、增殖,并誘導其凋亡,PPARγ有可能成為肺癌治療的潛在靶點。

[1]Takahashi N,Okumura T,Motomura W,et al.Activation of PPAR-gamma inhibits cell growth and induces apoptosis in human gastric cancer cells[J].FEBSLett,1999,455(1-2):135-139.

[2]Chinetti G,Griglio S,Antonucci M.Activation of proliferatoractivated receptors alpha and gamma induces apoptosis of human monocytederived macrophages[J].J Biol Chem,1998,273(40):25573-25580.

[3]Chacko BK,Chandler RT,D'Alessandro TL,et al.Anti-inflammatory effects of isoflavones are dependent on flow and human endothelial cell PPAR[J].Nature,2007,137(2):351-356.

[4]馬秀梅.胃癌 Skp 2、Heparanase、NF-κB和 PPARγ的表達及 15d-PGJ2和 RNA干擾沉默 PPARγ對胃癌細胞生長的影響及機制[D].河北醫科大學,2006.