白藜蘆醇對人食管癌細胞 Eca-109增殖的影響及其機制探討

韓忠敏,井長勤

(1鄭州鐵路職業技術學院,鄭州 450052；2新鄉醫學院)

白藜蘆醇(Res)屬非黃酮多酚類物質,是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物,因首先在歐洲的白藜蘆中被提取而得名。體內外實驗發現,Res對腫瘤的起始、發展均有抑制作用[1]。新生血管生成是腫瘤細胞增殖生長的必備條件,血管內皮細胞生長因子 (VEGF)是最重要的血管內皮生長刺激因子。2008年 6月 ～2009年 1月,我們觀察了 Res對人食管癌細胞 Eca-109增殖的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109,常規培養于含 10%胎牛血清的 DMEM培養基中,置 37℃、飽和濕度為 5%的CO2培養箱孵育,0.25%胰酶-EDTA消化傳代至對數生長期；Res(純度 99%),用二甲基亞砜(DMSO)溶解,母液濃度為 100 mmol/L,-20℃避光保存；DMEM培養基,總 RNA提取試劑盒,cDNA合成試劑盒及 PCR擴增試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 Eca-109細胞增殖情況觀察 采用 MTT法。調整細胞濃度為 1.5×104/ml,取 200μl接種于 96孔板。24 h后觀察組加入終濃度為 10、20、40 μmol/L的 Res,對照組加入 DMSO,每組設 4個復孔。于培養 24、48、72 h,吸盡舊培養液,每孔加 20 μl MTT(5 g/L)繼續培養 4 h。吸盡培養液,加入DMSO,振蕩至紫色結晶完全溶解。用酶標儀測定每孔 570 nm的吸光度 A值,計算細胞生長抑制率(IR)。IR(%)=(實驗組 A570-對照組 A570)/對照組 A570×100%。

1.2.2 Eca-109細胞 VEGF mRNA檢測 采用 RTPCR法。應用 Primer 5.0軟件設計 VEGF引物序列,由上海生工生物公司合成。以管家基因 GAPDH的 cDNA起始模板數對 VEGF基因的起始模板進行標化,設定無 cDNA樣品的空白管為陰性對照。采用 Trizol一步法提取總 RNA,紫外分光光度計測樣品 A260和 A280值,瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA質量。按逆轉錄試劑盒說明書操作,反轉錄合成 cDNA,用以 PCR反應。PCR擴增產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色。凝膠圖像分析系統以 VEGF與 GAPDH電泳帶的吸光度比值作為 VEGFmRNA表達量。

1.2.3 統計學方法 采用 SPSS12.0軟件分析。數據比較用 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組 Eca-109細胞 IR比較 見表1。

表1 兩組 Eca-109細胞 IR比較(%,±s)

表1 兩組 Eca-109細胞 IR比較(%,±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01

組別 IR 24 h 48 h 72 h觀察組10μmol/L 3.20±0.02* 6.71±0.02* 13.52±0.12*20μmol/L 23.32±2.13*43.21±3.87* 54.52±2.87*40μmol/L 46.72±3.89*65.08±5.70# 87.71±3.70#對照組 0 0 0

2.2 兩組 Eca-109細胞 VEGF mRNA表達比較見表2。

表2 兩組 Eca-109細胞 VEGF mRNA表達比較(±s)

表2 兩組 Eca-109細胞 VEGF mRNA表達比較(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01,#P＜0.05

組別 VEGF mRNA 24 h 48 h 72 h觀察組10μmol/L 1.102±0.054*1.010±0.052*0.875±0.254#20μmol/L 0.912±0.046*0.835±0.043*0.526±0.312#40μmol/L 0.212±0.032*0.156±0.025*0.107±0.209#對照組 1.814±0.062 1.711±0.059 1.426±0.326

3 討論

Res是許多植物在受到真菌感染、紫外線照射或病理狀況下產生的一種植物抗毒素,具有多種生物活性,因其對腫瘤的抑制作用而備受關注,被認為是天然化學防癌劑之一。目前,對 Res的抗癌機制尚不清楚,認為其抗癌機制是多途徑的。Latruffe等[2]研究發現,Res可以抑制肝癌細胞 HepG2及結腸癌 SW480細胞從 S期進入 G2/M期,并呈劑量依賴關性。Park等[3]研究表明,Res能誘導人早幼粒白血病細胞向非增殖表型分化,提示其在腫瘤發展階段亦有明顯的抑制作用。喬振奎等[4]研究發現,Res可通過抑制前列腺癌細胞株 PC-3中 VEGF-C的表達發揮抗腫瘤活性。李永軍等[5]采用流式細胞技術檢測 Res誘導食管癌 Eca-109細胞凋亡的作用,認為與其增加細胞凋亡相關基因 survivin、Bax和 Bc1-2的表達有關。

VEGF是體內外血管內皮細胞最主要的有絲分裂原,通過選擇性地與血管內皮細胞膜上高親和力的受體酪氨酸激酶結合,使受體磷酸化而活化,然后進一步激活其下游的相關基因表達,刺激內皮細胞遷移與增殖；同時,VEGF也可增加血管內皮的通透性,血液中的營養物質進入腫瘤細胞間隙,使腫瘤直接獲得營養；此外,VEGF還能誘導某些抗凋亡因子如 Bcl-2、X1-AP等的表達,抑制血管內皮細胞凋亡。葉春祥等[6]研究發現,VEGF在食管鱗狀上皮細胞中的異常表達與食管癌組織中淋巴管生成和淋巴結轉移密切相關,說明 VEGF表達水平可作為食管癌患者預后判斷及轉移的參考指標。

本研究結果發現,Res對食管癌細胞 Eca-109增殖具有抑制作用,且隨藥物濃度的增加,培養時間延長,抑制率升高,呈時間和劑量依賴關系；RT-PCR證實,一定濃度的 Res對 Eca-109中 VEGF mRNA的表達有抑制作用,提示 Res可能通過抑制食管癌細胞中 VEGF基因的表達而發揮抗腫瘤作用,為臨床 Res治療食管癌提供了理論依據。

[1]Kundu JK,Chun KS,Kim SO,et al.Resveratrol inhibitsphorbol ester-induced cyclooxygenase-2 expression in mouseskin:MAPKs and AP-1 as potential molecular targets[J].Biofactors,2004,21(1-4):33-39.

[2]Latruffe N,Delmas D,Jannin B,et al.Molecular analysiss on the chemopreventive properties of resveratro,a plantpolyphendmicrocomponent[J].Int JMol Med,2002,10(6):755-760.

[3]Park JW,Choi YJ,Jang MA,et al.Chemopreventive agent resveratrol,a natural product derived from grapes,reversibly inhibits progression through S and G2 phases of the cell cycle in U937 cells[J].Cancer Lett,2001,163(1):43-49.

[4]喬振奎,徐萬海,王曉民,等.白藜蘆醇對人前列腺癌 PC-3細胞株 VEGF的表達及細胞增殖的影響[J].實用腫瘤學雜志,2009,23(3):242-244.

[5]李永軍,孫曉慧,王崇.白藜蘆醇誘導食管癌細胞凋亡及其相關基因表達的研究[J].檢驗醫學,2009,24(3):196-200.

[6]葉春祥.VEGF-C在食管癌中的表達及其與淋巴結轉移相關性研究進展[J].四川生理科學雜志,2009,31(1):35-36.