食管鱗癌組織中 h MLH1 mRNA的表達(dá)變化及意義

葉骉飛,李惠武,龐作良,李 卉,田 勍,郭文佳,王洪江*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心)

目前,食管癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。DNA損傷修復(fù)基因可使受損的 DNA分子恢復(fù)正常,得以保持細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和正常功能,其在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注。2008年 1月 ～2009年 5月,我們采用 RT-PCR法檢測(cè)了 60例食管鱗癌組織與癌旁組織中錯(cuò)配修復(fù)基因 hMLH1 mRNA的表達(dá)變化,并探討其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 食管鱗癌患者 60例,其中男 43例、女 17例,年齡 36～75歲；UICC病理分期(1997年)Ⅰ期 2例,Ⅱa期 18例,Ⅱb期 19例,Ⅲ期 21例；分化程度為高分化 16例,中分化 36例,低分化8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 35例,無(wú)轉(zhuǎn)移 25例；術(shù)前均未行放療、化療；均留取患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本,-70℃冰箱保存。

1.2 hMLH1 mRNA檢測(cè)方法 采用 RT-PCR法。取 0.1 g組織,加入 1 ml預(yù)冷的 Trizol提取液,充分勻漿。嚴(yán)格按 Trizol-RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA的含量及純度。所得總 RNA溶解于 50μl DRPC處理水中,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后再以 cDNA為模板擴(kuò)增。取 6μl擴(kuò)增產(chǎn)物,于 20 g/L瓊脂糖中進(jìn)行凝膠電泳,在凝膠成像儀上照相,計(jì)算目的基因 hMLH1與 GAPDH產(chǎn)物灰度值比值,以此作為 hMLH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)計(jì)量資料兩樣本比較采用 t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)及 Fisher精確概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

食管鱗癌組織中 hMLH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.761 7±0.035 7)明顯低于癌旁正常組織(1.025 2±0.047 4),P＜0.05；hMLH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。由表可見(jiàn),hMLH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與食管癌分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P均 ＞0.05),與病理分期有關(guān)(P＜0.05)。

表1 hMLH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

在細(xì)胞增殖過(guò)程中,DNA損傷是一種比較普遍的現(xiàn)象。遺傳信息得以完整穩(wěn)定的代代相傳,依賴(lài)于生物進(jìn)化過(guò)程中形成的 DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。至今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 9種與人類(lèi)活動(dòng)有關(guān)的 DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)基因。hMLH1是 MMR基因系統(tǒng)中的重要成員[1],位于人類(lèi)染色體 3p21.3～3p23,全長(zhǎng) 2 484 bp,含有 19個(gè)外顯子,編碼長(zhǎng)度為 2 268 bp的開(kāi)讀框,表達(dá)產(chǎn)物是 756個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。hMLH1基因突變或啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)生無(wú)功能截短蛋白或翻譯沉默,無(wú)法識(shí)別錯(cuò)配位點(diǎn),從而不能啟動(dòng)修復(fù),錯(cuò)配的 DNA不能被修復(fù),突變基因進(jìn)一步積累,引起基因組的不穩(wěn)定,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

DNA錯(cuò)配修復(fù)能力低下與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。在散發(fā)性大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤中,均存在MMR系統(tǒng)的異常[2],常表現(xiàn)為 hMLH1基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[3]。本研究結(jié)果顯示,食管鱗癌組織中hMLH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(P＜0.05),與賈瑞等[4]的研究結(jié)果一致。也有研究結(jié)果顯示,hMLH1表達(dá)在食管不典型增生組織和腫瘤組織中均低于食管正常組織(P均 ＜0.05)[5]。本研究中 hMLH1在癌旁組織中表達(dá)水平雖然很高,但仍有少部分未表達(dá),提示癌旁正常組織中 hMLH1也可能存在缺失、突變或其他方式的失表達(dá),這說(shuō)明 hMLH1表達(dá)缺失或突變是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期分子事件之一,即早期就參與了食管鱗癌的發(fā)生或發(fā)展。有研究顯示,hMLH1 mRNA表達(dá)從正常食管組織、食管非典型增生組織、原位癌到食管癌組織的過(guò)程中呈明顯遞減趨勢(shì)[6]。這表明 hMLH1可能是癌前病變發(fā)展到原位癌期的事件,提示在食管癌癌前病變中檢測(cè)hMLH1指標(biāo)具有重要意義。本研究還發(fā)現(xiàn),在食管鱗癌組織中,hMLH1 mRNA在不同浸潤(rùn)深度、不同分化程度和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P均 ＞0.05),也說(shuō)明 hMLH1是食管癌發(fā)生的早期事件。hMLH1 mRNA表達(dá)水平與臨床分期有關(guān),分期越晚,表達(dá)水平越低,說(shuō)明 hMLH1低表達(dá)預(yù)示食管鱗癌的晚期,預(yù)后較差。

[1]Ellison AR,Lofing J,Bitter GA.Human mutl homolog(MLH1)Function in DNAmismatch repair:A prospective screen for misssense mutation in the ATPasedomain[J].Nucleic Acids Res,2004,32(18):5321-5338.

[2]Wang H,Douglas W,Lia M,et al.DNA mismatch repair deficiency accelerates endometrial tumorigenesis in Pten heterozygousmice[J].Am J Pathol,2002,160(4):1481-1485.

[3]Uehara H,Miyamoto M,Kato K,et al.Deficiencyof hMLH 1 and hMSH 2 expression is a poor prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma[J].J Surg Oncol,2005,92(2):109-115.

[4]賈瑞,陳志濤,王丹云,等.hMLH1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌和不典型增生組織中的表達(dá)[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2007,14(2):169-172.

[5]呂全新,李惠翔,高冬玲,等.食管鱗狀細(xì)胞癌及不典型增生組織中hMLH1基因道白表達(dá)的研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2005,14(4):377-379.

[6]焦云娟,蘇蔚,王芳,等.食管黏膜上皮癌變過(guò)程中 hMLH 1的表達(dá)及意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(2):116-118.