康寧木霉誘變菌株產酶條件的研究

刁彩霞，甘文平，麻名漢

（黑龍江省農墾科學院畜牧特產所，哈爾濱 150038）

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，微生物對其降解、轉化是自然界中碳元素轉化的主要環(huán)節(jié)。纖維素的生物轉化與利用對解決當前世界能源危機、糧食短缺和環(huán)境污染等問題具有重要意義。近年來，我國對纖維分解菌的應用研究十分活躍，已篩選出具有獨特的纖維素分解作用的高產菌株，其在長期保存新鮮秸稈營養(yǎng)成分的同時，可降低纖維素、半纖維素、木質素的含量，不僅適口性好，保存期長，而且操作簡便，成本低，為糧食主產區(qū)發(fā)展畜牧業(yè)提供了廣闊的飼料資源[1-9]。

為此，本研究小組開展了混合菌株在東北地區(qū)主要農作物玉米秸稈和稻草上的應用研究，本文主要對2株產纖維素酶較高的黑曲霉菌株和康寧木霉菌株進行了產酶效果的比較研究，并進一步摸索了培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑：水楊素、羧甲基纖維素鈉；試驗中所用其他試劑均為分析純。

菌種及培養(yǎng)基：黑曲霉（Aspergillitus niger）jg1、康寧木霉（Trichoderma koningii）jg2由本研究室保藏。

斜面培養(yǎng)基：黑曲霉jg1采用PDA培養(yǎng)基，康寧木霉jg2采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

三角瓶培養(yǎng)基：黑曲霉：稻草粉 50 g·L－1、麥麩 10 g·L－1、（NH4）2SO410 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1。康氏木霉培養(yǎng)基中含稻草粉 50 g·L－1、麥麩10 g·L－1、牛肉蛋白胨 5 g·L－1、起始 pH 5.0。

誘變初篩培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g·L－1，牛肉蛋白胨 5 g·L－1，瓊脂 14 g·L－1，剛果紅 0.2 g·L－1，脫氧膽酸鈉 10 g·L－1，pH 5.0。

1.2 試驗方法

將黑曲霉和康寧木霉菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～6 d后使用或在4℃下保存，250 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，121℃滅菌20 min，接種用生理鹽水沖洗的孢子1mL（孢子數(shù)107個·mL－1），28 ℃ 在 120 rpm 搖床上振蕩培養(yǎng)168 h，離心上清液即為粗纖維素酶液。

pH用酸度計測定。纖維素、半纖維素和木質素的測定參考王建兵的方法[10]。殘余還原糖的測定采用DNS法。

酶活力的測定采用CMC酶活性測定方法，取適當稀釋的酶液0.5 mL，加入1%的CMC溶液（溶于 pH 4.8 的 0.1mol·L－1HAc-NaAc緩沖液中）1mL，50℃ 保溫 30 min，加入 DNS試劑3 mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到25mL，在520 nm處測還原糖。濾紙酶活力的測定：取適當稀釋的酶液0.5 mL，加入緩沖液（pH 4.8 的 0.1 mol·L－1HAc-NaAc）1mL中，并加入1條1×6 cm的濾紙，500℃保溫1 h，加入DNS試劑3mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到25mL，在520 nm處測還原糖。β-葡萄糖苷酶活力測定：取適當稀釋的酶液0.5mL，加入1 mL質量分數(shù)為 1%的水楊素溶液（溶于pH 4.8的0.1mo1·L－1HAc-NaAc緩沖液中）。50 ℃ 保溫30min，再加入DNS試劑3mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到 25 mL，在 520 nm處測還原糖。

2 結果與分析

2.1 受試菌種產纖維素酶能力的比較

以秸稈為主要碳源，對受試菌種三角瓶產纖維素酶的水平進行了反復比較，結果見表1。

表1 受試菌種產酶能力的比較

由表1可見，康寧木霉jg2產酶較高，殘余還原糖較少，故選用康寧木霉jg2進行后續(xù)研究。

2.2 康寧木霉jg2誘變前后產酶能力的比較

為了提高康寧木霉產纖維素酶的能力，對其進行了紫外線和硫酸二乙酯（DES）復合誘變，經初篩、復篩獲得了誘變菌株jg4，其產酶能力情況見表2。

由表2可見，經誘變后各組分均有一定程度的提高，由硫酸二乙酯誘變后的菌種為康寧木霉jg4，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上傳代5次，每代進行發(fā)酵酶活力測定，發(fā)現(xiàn)產酶能力沒有大的變化，說明其遺傳穩(wěn)定性較好，故以此菌種進行后續(xù)試驗。

表2 康寧木霉jg2經誘變后產酶能力的變化

2.3 不同碳源對康寧木霉jg4產酶的影響

分別以稻草粉、秸稈粉、麥麩（均過80目篩）取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，研究了碳源對產酶的影響，結果見表3。

由表3可見，康寧木霉jg4以稻草為碳源的酶活力最高，其次是秸稈，麥麩最低。

表3 不同碳源對康寧木霉jg4產酶的影響

2.4 不同氮源對康寧木霉jg4產酶的影響

選取常用的氮源：豆餅、蛋白胨、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、尿素為研究因素，比較不同氮源對康寧木霉jg4產酶的影響，結果見表4。

由表4可見，無機氮對康寧木霉jg4產酶的影響優(yōu)于有機氮，氨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮，（NH）4SO4為氮源時 CMCCase、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶活力皆最高，殘余還原糖量也處于較低的水平，這一結果與李愛華等的試驗結果一致[11]。因此，本研究選用（NH）4SO4作為氮源。

表4 不同氮源對康寧木霉jg4產酶的影響

2.5 通氣量對康寧木霉jg4產酶的影響

250 mL三角瓶裝填不同體積的培養(yǎng)基，進行產酶試驗，結果見表5。

由表5可見，250mL三角瓶裝30～60 mL培養(yǎng)基均能獲得較佳的產酶效果，但隨著裝液量的繼續(xù)增加，產酶水平逐漸下降，這可能是由于供氧不足，不利于康寧木霉的生長。本試驗選擇了40mL培養(yǎng)基。

表5 通氣量對康寧木霉jg4產酶的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對康寧木霉jg4產酶的影響

培養(yǎng)溫度對康寧木霉jg4產酶也有很大的影響，本研究選擇了不同溫度進行發(fā)酵試驗，結果見表6。

從表6可見，30℃產酶水平最高，較低溫度對康寧木霉jg4產酶不利，可能是因為較低溫度會影響菌絲體的生長。

表6 培養(yǎng)溫度對康寧木霉jg4產酶的影響

2.7 接種量對康寧木霉jg4產酶的影響

試驗用孢子懸浮液，孢子為麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)4～6 d后，用生理鹽水充分沖洗得到，用不同體積的孢子懸浮液接種見表7。

由表7可見，接種量對產酶影響不大，本研究選擇接種2mL抱子懸浮液、30mL發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.8 培養(yǎng)時間對康寧木霉jg4產酶的影響

根據(jù)上述試驗結果，選擇三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草2.4 g，麥麩1.2 g，（NH4）2SO41%，裝液量40mL，轉速140 rpm，培養(yǎng)溫度30℃，每 12 h取 1次樣，研究殘余還原糖及纖維素酶活力的變化，結果見圖1、2。

從圖1可見，在發(fā)酵過程中，由于菌體生長消耗，殘余還原糖先下降，隨后上升，說明康寧木霉產生了水解酶，將麥麩和稻草粉降解為還原糖，但隨著發(fā)酵的進行，還原糖會逐漸被菌體消耗而下降。

表7 接種量對康寧木霉jg4產酶的影響

圖1 搖瓶發(fā)酵過程中殘余還原糖變化

圖2 搖瓶發(fā)酵過程中FPA, β-葡萄糖苷酶，CMC酶活力的變化

從圖2可見，康寧木霉jg4發(fā)酵過程中CMC酶活曲線有兩個峰值，36 h時CMC酶活力出現(xiàn)第1個高峰，酶活力達80.45 U·mL－1，隨后緩慢下降，其最高峰值出現(xiàn)在132 h，隨后緩慢下降；濾紙酶活力和β－葡萄糖苷酶活力也在132 h出現(xiàn)峰值。

3 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對康寧木霉jg4產酶均有顯著影響，當以稻草粉和秸稈為主要碳源時，有利于康寧木霉jg4發(fā)酵產酶，這表明其產酶為誘導酶，在試驗中氮源選用硫酸銨較好，說明康寧木霉jg4利用無機氮的能力較強。試驗表明，康寧木霉jg4液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：稻草粉 50 g·L－1，麥麩 10 g·L－1，硫酸銨 10 g·L－1，裝液量40mL，pH自然。發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，轉數(shù)120 rpm，培養(yǎng)時間為132 h。

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