FASN和p97在骨肉瘤組織中的表達及其與骨肉瘤遠處轉移的關系

劉志禮 羅慶豐 黃山虎 周 揚 王 高 鄒平安 舒 勇

骨肉瘤是好發于青少年的1種惡性程度很高的侵襲性疾病，雖然隨著化療藥物的發展，生存率有了較大的提高，但是行截肢及化療后仍有約40%患者死于腫瘤肺轉移［1］，根本原因是80% ～90%的患者在確診時全身微病灶轉移就已存在［2］，所以早期發現腫瘤轉移是影響腫瘤治療效果的重要因素，所以尋找1種參與腫瘤遠處侵襲及轉移的標記物為早期判斷腫瘤是否發生遠處轉移是非常重要。我們采用免疫組織化學染色的方法，檢測FASN和p97蛋白在骨肉瘤組織中的表達，以了解它們在骨肉瘤的發生與轉移中的作用，為進一步研究其參與骨肉瘤遠處轉移提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源與病例資料

選取南昌大學一附院、江西省腫瘤醫院、江西省人民醫院、浙江省余姚市人民醫院2002年至2009年經手術切除的骨肉瘤組織標本60例:其中有肺轉移者13例，口腔轉移1例;男性34例，女性26例;年齡7～74歲，平均年齡18.4歲;骨母細胞型36例，纖維母細胞型15例，軟骨母細胞型9例;股骨遠端26例，脛骨近端16例，腓骨近端7例，肱骨近端7例，上頜骨2例，額骨2例。全部標本均經臨床、影像學及病理組織學檢查確診為骨肉瘤。手術前所有病例均未經放療及化療，術前均行腫瘤局部X線攝片、肺部CT、胸片、全身骨掃描等檢查。以21例骨軟骨瘤作為對照組。

1.2 方法

采用免疫組化SP法，兔抗FASN、p97多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，以已知陽性組織切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，按1∶800稀釋;二抗兔/鼠雙標ChenMate TM EnVision HRP試劑盒購自Gene Company Limited;標本行免疫組化染色。常規脫蠟水化組織切片，組織抗原熱修復pH 6.0檸檬酸緩沖液，微波高檔20 min，10%山羊血清封閉，滴加一抗4℃過夜。滴加生物素標記的二抗室溫育45 min，滴加辣根酶標記的鏈霉素卵白素，室溫溫育45 min。各步驟之間以PBS沖洗，5 min連續3次。DAB顯色，蘇木精復染，封片后在光鏡下觀察。

1.3 染色結果判定標準

FAS染色陽性表現為細胞胞質中出現棕黃色顆粒。采用半定量方法表達結果，將標本切片的染色強度和染色范圍分別記分后相加，所得的分數即為最后的評分。評分方法參照 Pizer［3］，染色強度，0分:染色為陰性;1分:染色為弱陽性(淺棕色);2分:染色為陽性(棕色);3分:染色為強陽性(深棕色)。染色范圍:0分為不顯色;1分為陽性細胞數＜10%;2分為陽性細胞數11% ～50%;3分為陽性細胞數51% ～80%;4分為陽性細胞數≥81%。病理切片染色結果判定，由兩名病理科醫師盲法獨立閱片完成，核對結果，取得共識。結果:①陰性表達:FAS評分＜4分為(－);②陽性表達:FAS評分≥4分;其中4分為(+)，5分為(++)，≥6分為(+++)。

1.4 統計學處理

應用SPSS13.0統計軟件包，對所得的數據進行χ2檢驗，Spearman等級相關分析兩蛋白之間的相關性。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白的表達情況

FASN和p97蛋白染色陽性物彌漫分布于細胞質中，呈深淺不一的棕黃色顆粒，p97蛋白在部分細胞核中亦有分布。在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中FASN陽性表達率分別為60.0%(36/60)和28.6%，(6/21)有統計學差異(P＜0.05);p97蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤中陽性表達率分別為68.3%(41/60)和8.1%(4/21)，有統計學差異(表1)。

2.2 骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達的相關性

骨肉瘤中FASN與p97蛋白表達程度的相關性分析，Spearman相關系數 γ =0.7，P ＜0.01(表1)。

2.3 FASN和p97表達與骨肉瘤遠處轉移的關系

發生遠處轉移骨肉瘤患者中FASN和p97蛋白陽性表達率分別為85.7% 和 92.9%，明顯高于無遠處轉移骨肉瘤組織中 FASN(52.2%，24/46)和 p97(60.9%，28/46)陽性表達率，兩者差異有顯著意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 FASN和p97表達與骨肉瘤病理組織學分型的關系

骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達與骨肉瘤病理組織學分型無關(表1)。

表1 FASN、p97表達及其與骨肉瘤轉移的關系

3 討論

3.1 FASN與腫瘤的發生、發展

20世紀80年代末，有學者發現某些乳腺癌組織能夠產生1種可與抗結合球蛋白抗體反應的蛋白質，稱之為結合球蛋白相關蛋白(Hpr)或癌源性抗原OA519，該抗原與較差的預后密切相關，經過序列分析確定 Hpr就是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)。Menendez等［4］研究表明FAS在腫瘤細胞中對細胞生存的作用遠遠大于在正常細胞中的作用，且FASN表達強度與腫瘤的惡性程度密切相關，是1種新的癌基因。FAS是內源性脂肪酸合成的關鍵酶，廣泛存在于動、植物組織細胞中，位于細胞胞質內，是1種大分子蛋白復合物，活性形式的FAS是以頭尾相對排列的二聚體形式，具有包括縮合、轉酰、還原、脫水在內的7種酶活性，能夠催化丙二酰輔酶A、乙酰輔酶A和還原型輔酶Ⅱ體內合成為長鏈(16碳)飽和軟脂酸鹽，參與細胞的能量供給等多種生物學功能。除了哺乳期的乳腺和周期性的子宮內膜外，FAS在幾乎所有的正常組織中都只是低水平的表達。而腫瘤細胞的脂肪酸合成卻發生紊亂，已經發現多種組織來源的腫瘤細胞進行著過量的內源性脂肪酸的生物合成，腫瘤細胞的生長依賴于內源性的脂肪酸合成，從這些腫瘤組織中分離培養所得的細胞株也用內源性的脂肪酸完成多項生物學功能。而且脂肪酸合成酶在82%的因患惡性腫瘤而死亡的患者腫瘤組織中過度表達且具有高活性，在培養的腫瘤細胞或異種移植動物模型中，FASN的表達模式也與此相似［5］。FASN在腫瘤中的過度表達與磷脂酰肌醇23激酶/PTEN/AKt Kinase途徑有關［6］。FASN在多種惡性腫瘤細胞中存在高表達［7～11］，并且發現 FASN 的高表達與膀胱、前列腺、乳腺等多種惡性腫瘤的組織分化及預后明顯相關［12，13］。我們在前期小樣本研究中［14～16］采用免疫組織化學法和Western Blotting方法，發現FASN在人骨肉瘤組織與細胞株U2-OS中高表達。在本研究中60骨肉瘤組織中FASN陽性表達率分別為60.0%(36/60)，而在骨軟骨瘤組織中陽性表達率只有28.6%(6/21)，有統計學差異;但是骨肉瘤組織中FASN和p97蛋白表達與患者性別、年齡和WHO組織學分型無關。本研究中伴有骨肉瘤遠處轉移組FASN蛋白陽性表達率高達85.7%(12/14)，無遠處轉移組僅為 52.2%(24/46)，兩者差異有顯著意義，很可能FASN蛋白參與了骨肉瘤的遠處轉移，與文獻報道的結果相似［17］。

3.2 p97蛋白與腫瘤

p97蛋白是1種對于細胞生存必不可少的蛋白質，在一些增生活躍的細胞中高度表達。它是ATP酶相關活性(AAA)超家族的成員，在細胞活動中主要起著分子伴侶的作用，參與膜的融合、轉錄活性的調節、細胞周期的調節、內質網相關蛋白的降解及介導細胞黏附、凋亡等生理病理過程。有文獻報道［18～22］p97蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達，如食管癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌，并且參與腫瘤的遠處轉移。本研究中p97蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤組織中陽性表達率分別為68.3%(41/60)和 8.1%(4/21)，統計學差異明顯，但是與骨肉瘤病理組織學類型無關;在伴有骨肉瘤遠處轉移組中p97蛋白陽性表達率為92.9%，明顯高于無遠處轉移組(60.9%，28/46)，這也提示p97蛋白可能參與骨肉瘤的遠處轉移。

從本研究結果分析，FASN與p97蛋白在骨肉瘤組織中呈高表達，推測這2種蛋白很可能參與了骨肉瘤的發生，Murata等［23］通過動物實驗研究發現，使用藥物抑制FASN的表達和活性可以抑制直腸癌的肝轉移發生率，說明FASN很可能參與了直腸癌的遠處轉移。另外，本研究還發現，FASN與p97在骨肉瘤組織中表達呈顯著正相關，表明兩者在骨肉瘤的發生和進展中很可能存在一定程度的協同效應，我們推測FASN和p97很可能參與了骨肉瘤的遠處轉移，可為骨肉瘤的基因及藥物治療的靶點。但是本研究因為轉移組的樣本量小，并且要說明某種蛋白是否參與腫瘤的遠處轉移還需要通過大量的實驗來證實，本研究為進一步研究FASN和p97蛋白是否參與惡性腫瘤的遠處轉移和機制提供理論依據。

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