泛素-蛋白酶體通路與腫瘤發生的研究進展

張丹丹綜述 張玉泉審校

泛素-蛋白酶體復合通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是Hershko等在20世紀末發現的1種高效蛋白質降解通路，該通路通過蛋白酶體選擇性降解細胞內泛素化的蛋白質，不但能夠破壞損傷陳舊的蛋白質，而且能夠參與調節細胞的多種重要生命過程，精確降解細胞內各種目的靶蛋白，進而參與基因轉錄、細胞周期調節，以及受體胞吞、抗原呈遞等各種細胞生理過程［1］。UPP的發現被認為是細胞周期、細胞惡性轉化和免疫學研究的轉折點。目前的研究顯示，UPP與一系列女性生理過程和婦科疾病的發生有密切關系。

1 泛素的結構

泛素只存在并廣泛存在于真核生物，是由76個氨基酸組成的多肽，相對分子量為8.45×103，是1種非常小的球形蛋白，常常通過與其他蛋白共價結合而發揮生物學作用。泛素屬于熱休克基因家屬，具有高度保守性，在人與酵母之間也僅有3個氨基酸的差別。X線衍射分析泛素，包括4個β片層和1個α螺旋，共形成3個半轉角，為1個緊密的球形結構。泛素基因有2種典型的存在狀態:1種是Ub基因結合到核糖體蛋白基因上;另1種是以重復基因編碼出線形的泛素分子鏈，即多聚泛素分子(polyubiquitinmolecule)。各個泛素單體之間可通過不同的氨基酸殘基連接，并與底物蛋白連接成泛素多聚鏈，具有不同的功能。泛素單體間主要的連接殘基為第48位的賴氨酸(Lys48)，而形成泛素多聚鏈的殘基有Lys6、Lys11、Lys29、Lys63。通過不同的連接，泛素可以標記不同的蛋白底物，連接時都需要ATP水解提供能量。

2 泛素-蛋白酶體通路

泛素-蛋白酶體通路是生物體內進行蛋白質選擇性降解的重要途徑之一。主要包括泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素連接酶(ubi-quitin-conjugating enzyme，E2)、泛素蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)、26S蛋白酶體及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUBs)等。動物細胞有2套蛋白酶體:①20S蛋白酶體，負責蛋白酶的激活并形成26S蛋白酶體的核心;②26S蛋白酶體，負責催化ATP依賴的泛素化蛋白的降解。

2.1 蛋白質泛素化降解途徑

2.1.1 泛素的活化 泛素通過E1和E2被激活的過程稱為泛素的活化。泛素的活化過程是1個依賴ATP的酶促反應(見圖1):①首先由ATP提供能量，泛素C末端的甘氨酸(Gly)被泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme E1)催化，形成Ub-腺苷酸中間產物，C末端被激活，然后激活的C末端被轉移至E1酶內Cys殘基的-SH鍵上，形成高能硫酯鍵;②通過轉酰基作用，含有高能硫酯鍵的泛素進一步轉移到泛素載體蛋白(ubiquitin conjugating enzyme，E2)特異的Cys殘基上，形成E2-Ub巰基酯，E2-Ub巰基酯可使泛素C端甘氨酸與底物蛋白的Lys殘基的氨基形成共價鍵;③在大多數情況下，底物蛋白先與泛素連接酶(ubiquitin ligating enzyme，E3)特異性結合，E3可使E2和底物蛋白相互接近，繼而蛋白底物與E2酶連接的泛素結合，完成了底物蛋白質的泛素化。泛素也可以直接從E2轉移給底物蛋白形成Ub蛋白復合物，這時的底物多為堿性蛋白 (如組蛋白)。泛素連接酶是泛素-蛋白酶體系統的重要成分，在癌形成過程中扮演著重要的角色［2］。

2.1.2 蛋白底物的降解 蛋白底物與泛素形成Ub蛋白復合物后，特異空間結構被展平，進入26蛋白酶體的催化中心降解。在26S蛋白酶體(proteasome)中(見圖2)，中部20S蛋白酶體呈筒狀外形，由內層2個β環和外層2個α環組成，α亞基主要用于底物識別，β亞基則負責底物降解。α亞單位環組組成20S蛋白酶體圓桶狀結構的兩端，環口中央被α亞單位N末端肽鏈占據，使α環的外側完全關閉，其功能是阻止非目的靶蛋白質進入20S內被降解。近期有一項研究顯示20S亞單位的組裝是由哺乳動物細胞蛋白酶體生物合成的關鍵因子—蛋白酶體成熟蛋白(proteasomematuration protein，POMP)促進其在內質網內完成［3］。19S調節復合體可分為蓋子(1id)和底座(base)2個次級復合物，底座位于20S蛋白酶體兩側，可加速底物泛素化及α環口開啟，蓋子是多聚泛素蛋白的受體。19S復合體主要起調節作用，特異性識別并結合泛素化的靶蛋白，改變靶蛋白構象。泛素化蛋白被識別后轉移至核心蛋白被降解［4］，而負責“標記”靶蛋白的泛素被解離下來，釋放到胞質中循環重復使用［5］。

2.1.3 泛素的再循環 泛素屬于長壽命蛋白，在泛素系統中存在能夠特異切割泛素鏈的C末端的泛素解離酶(DUBs)。在泛素蛋白偶連物水解之前，泛素解離酶將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族，根據其催化機制，可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)。DUBs能夠特異性識別泛素C末端與相連的最后1個殘基(Gly76)分子之間形成的共價鍵，使其斷開。DUBs促進泛素分子再循環，是泛素系統的正常運行的必要成分。

圖1 泛素的活化過程

圖2 Ub蛋白復合物的降解

2.2 泛素-蛋白酶體途徑與腫瘤的關系

泛素-蛋白酶體途徑是細胞內ATP依賴的蛋白質選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內重要的蛋白質質控系統，參與細胞凋亡、MHCⅠ類抗原的遞呈、細胞周期以及細胞內信號轉導等多種生理過程，對維持細胞的穩態具有十分重要的意義［6］。有研究認為蛋白質的泛肽化與包括細胞凋亡在內的許多細胞活動過程有關［7，8］。UPP通過26S蛋白酶體降解一些與凋亡相關的蛋白，如轉錄因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，發揮調控細胞凋亡的作用。

2.2.1 UPP對轉錄因子NF-κB的調控 核因子kappa增強子結合蛋白 (nuclear factor kappa enhancer binding protein，NF-κB)是細胞中重要的轉錄因子，控制著細胞的免疫應答、炎性反應和凋亡等過程。泛素化調控著NF-κB活化過程當中的許多步驟:NF-κB的抑制子核因子kappaB抑制子(inhi-bitor of nuclear factor，kappa2B，IκB)的降解，IκB 激酶(IκB kinases，IKK)的活化等［9］。正常情況下細胞轉錄因子蛋白NF-κB活性被I-κB抑制，在誘導 NF-κB 的應激刺激下，激活 IκB 激酶(IKK)。NF-κB活化過程中，E3酶上的環指模TRAF6首先被細胞膜上的TNF受體和IL-1受體及其配體激活，然后與E2酶上的1個復合體泛素變構酶1A(ubiqitin emzyme 1A，UBC132UEV1A)共同作用，被K63泛素鏈修飾，K63泛素鏈可被特定的激酶受體蛋白的鋅指模序所識別［10］。泛素化的TRAF6募集相關的蛋白，以K63鏈為骨架進行裝配信號復合體，催化IKK的上游激酶TAK1〔轉換生長因子(transforming growth factor，TGFβ)激活激酶(TGFβ-activated kinase)〕磷酸化，進而激活 IKK，引起 IκBα磷酸化和泛素化，IκB的空間構象發生變化，從而被ATP依賴性26S的蛋白酶體所識別并降解，這一過程可被蛋白酶體抑制劑所阻斷［11］。IκB 的降解解除了對 NF-κB 的抑制作用，NF-κB被釋放至細胞核，激活抗凋亡基因如bcl-2等，發揮其抗凋亡作用，最終導致惡性腫瘤的發生。研究還發現腫瘤細胞中降解I-κB的蛋白酶體活性增加，細胞內NF-κB水平升高。

2.2.2 UPP對p53蛋白的調控 抑癌基因p53的表達產物可以通過激活靶基因實現凋亡調控功能，是細胞內重要的凋亡調控因子。E3RNG家族成員癌基因調節蛋白鼠雙微粒體(murine dou-bleminute 2，MDM2)作為1種癌基因蛋白具有負反饋調節p53的作用。MDM2含有環指樣結構域，具有泛素連接酶E3的作用，可以促進p53產物從核內向細胞質轉運，使之被泛素化后被26S蛋白酶體降解［12］而失去活性，MDM2具有抗凋亡作用。MDM2已經發現在多種腫瘤中表達明顯升高，是導致野生型p53在惡性腫瘤中表達降低的1個重要原因。Stedk等［13］在研究視網膜母細胞瘤時發現，在高表達MDM2的視網膜母細胞瘤細胞中，進入S期的腫瘤細胞明顯增多，凋亡細胞比例下降;敲除MDM2基因后，腫瘤細胞凋亡比例上升。在以往研究人乳頭瘤病毒(HPV)感染相關的人宮頸癌細胞時發現，高危組HPV引起的宮頸癌中，p53蛋白表達水平明顯降低，p53的功能被抑制。這是由于16或18型HPV編碼的癌蛋白E6可促進E3家族成員泛素蛋白連接酶E6-AP(E6-associated protein)和p53蛋白結合高，使p53蛋白被UPP過度降解［14］;而低危組的E6與p53蛋白則結合低，很少發生過度降解，故高危組HPV更易導致宮頸癌。Kelley等［15］研究證明E6蛋白幾乎所有與轉錄有關的功能均受到E6AP的調節。Borbely等［16］發現HPV16表達的E6蛋白可以通過對p53的泛素化降解，從而激活凋亡抑制基因survivin啟動子并誘導其轉錄。

2.2.3 UPP 與 Skp2 Skp2(S-期相關蛋白 2 S-phase kinase associated protein2)是F-box蛋白家族中成員之一。Skp2基因位于人染色體5p13，分子量約45 kd，能與s期激酶cyclinH-CDK2相互作用。Skp2作為SCF復合體(Skp1-Cullin-F-Box蛋白復合體)的底物識別亞基，能夠特異性識別底物并介導其泛素化降解。目前已證明，通過Skp2依賴性泛素-蛋白酶途徑可以降解許多細胞周期調控蛋白，如p27，p21，Cyclin D1和Cyclin E等等。p27是1種細胞周期蛋白抑制因子，能夠阻滯細胞周期的進展從而抑制細胞的增殖，是1個重要的細胞周期負性調控因子。Skp2能特異性識別p27，介導其泛素化降解，與腫瘤的形成關系密切。最近研究顯示，在p27缺失時，CyclinE-Cdk2可增加Skp2的磷酸化，這種磷酸化增加Skp2的自動泛素化，而p27可以抑制Skp2的磷酸化和自動泛素化［17，18］。已有大量的研究表明，在惡性實體腫瘤中p27常呈低表達，Skp2則常呈高表達，且兩者關系呈負相關。Sui等［19］用免疫組化法檢測卵巢腫瘤(33例良性和47例惡性)時發現，在卵巢的惡性腫瘤中Skp2的陽性表達率較良性腫瘤有所增加，且無論是在良性還是惡性卵巢腫瘤中，Skp2和p27之間都呈負相關。

2.2.4 UPP與抑癌基因VHL VHL基因產物pVHL是E3水解酶的組成成分之一，介導缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)泛素化降解，可抑制腫瘤間質血管的生成。VHL基因突變后，造成HIF表達水平上升，HIF誘導上皮細胞不斷增殖，并利于腫瘤的侵襲轉移。有實驗證明，由于在VHL基因缺陷引起腎細胞癌的裸鼠模型中，被導入VHL后，腫瘤生長受到抑制。Kim等［20］發現轉染了含VHL cDNA的腺病毒的腎透明細胞癌細胞株，可被誘導了凋亡，提示VHL與誘導腫瘤細胞的凋亡有關。

3 蛋白酶體抑制劑PS-341

針對泛素-蛋白酶體在腫瘤發生中的作用機制，國內外已對蛋白酶體抑制劑展開研究。根據蛋白酶體抑制劑與蛋白酶體的活性位點的蘇氨酸殘基反應的藥效基團，目前可將其分為5類:醛基肽類、硼酸肽類、乙烯磺基肽類、環氧酮類和β-內酯類。醛肽類是第一類被發現和廣泛應用的蛋白酶體抑制劑，但醛肽類化合物選擇性和穩定性較差，易被氧化。硼酸肽類比醛肽類具有更強的蛋白酶體抑制作用，更具選擇性，是比較理想的蛋白酶體抑制劑。其中，硼替佐米(Bortezomib，PS-341)選擇性高，副作用小，是首個被用于臨床的蛋白酶體抑制劑。該藥物已被證明可以通過特異性地抑制細胞內26S上糜蛋白酶活性，干擾細胞信號轉導通路，最終誘導腫瘤細胞凋亡［21］。美國FDA已批準該藥用于治療復發性、難治性多發性骨髓瘤。

在臨床前研究中發現，細胞培養中的PS-341可以誘導血液系統和實體瘤的惡性腫瘤的凋亡。PS-341通過調節前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的穩定性，以及抑制NF-κB的活化，誘導細胞凋亡。另有實驗證明PS-341抑制蛋白酶體干擾了未折疊蛋白質應答，引起內質網應激和增加凋亡。目前認為蛋白酶體抑制劑是1種潛在的抗癌與抗炎藥，通過抑制NF-κB活化可以減少細胞素、酶、細胞黏附分子的表達，從而發揮抗炎作用。在對多發性骨髓瘤、胰腺癌的小鼠模型以及前列腺癌裸鼠移植瘤模型的研究中發現，Bortezomib能明顯抑制腫瘤生長，提高生存率，減少腫瘤新生血管形成［22］。O’Connor等在PS-341的Ⅱ期臨床試驗中，給予淋巴瘤患者PS-341 1.5 mg/m2，結果顯示患者對PS-341有很好的耐受，PS-341對淋巴瘤患者有顯著的單劑效應，整體的反應率為58%［23］。

有文獻報道，胞苷脫氨基酶是1種具有抗HIV病毒的酶，而HIV的病毒感染因子加速該酶被UPP通路降解。蛋白酶體抑制劑可以阻斷UPP通路，從而保護胞苷脫氨基酶發揮抗癌作用。在PS-341的臨床Ⅰ期與Ⅱ期實驗中顯示了卓有成效的抗腫瘤作用和可控制的毒性作用。

隨著人們對腫瘤發生的分子機制逐漸深入的研究，越來越意識到泛素介導的蛋白質降解途徑在腫瘤發生中的重要性，逐漸把它作為腫瘤治療的主要靶點之一。許多研究表明，很多抑制蛋白酶體活性的藥物可以促進腫瘤細胞凋亡，殺死細胞，克服抗藥性，增強腫瘤細胞對放射治療的敏感性。相信隨著研究的深入，越來越多的蛋白酶體抑制劑將會用于腫瘤的治療中。

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