整合素αvβ3對喉鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲力影響的離體研究

許小濤 陶澤璋

有研究表明，整合素αvβ3在多種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、新血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移等主要惡性生物學(xué)行為中起正性調(diào)節(jié)作用［1］。整合素αvβ3可廣泛地表達(dá)于多種不同組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面，有研究［2，3］提示其在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展、新血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起促進(jìn)作用，從而整合素αvβ3有可能成為喉鱗癌治療的一個(gè)很有前途的靶點(diǎn)。為了探討整合素αvβ3在喉鱗癌主要惡性生物學(xué)行為中的作用，我們研究觀察整合素 αvβ3對體外培養(yǎng)HEP-2喉鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響，為將整合素αvβ3作為喉鱗癌治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人HEP-2喉鱗癌細(xì)胞株，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院耳鼻喉科分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供，小鼠成纖維細(xì)胞系(NIH3T3)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供。

1.1.2 主要試劑和藥物 RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(bovine calf serum，BCS)為Hyclone公司產(chǎn)品，PS雙抗(青霉素和鏈霉素)和胰蛋白酶購于武漢凌飛科技產(chǎn)品公司，MTT(噻唑藍(lán))為Amresco公司產(chǎn)品，二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide，DMSO)兔抗鼠PCNA單抗為美國Dako公司產(chǎn)品，兔抗鼠整合素αvβ3單抗為Santa Crux公司產(chǎn)品，即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒和黏片劑APES均購自武漢博士德公司。

1.1.3 主要儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀為Bio-Tek公司產(chǎn)品(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院骨科提供)，CO2培養(yǎng)箱為 Heal Force Development Co.Ltd(Hong Kong)產(chǎn)品，HPIAS-1000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理教研室提供，細(xì)胞培養(yǎng)池(Boyden小室)和Matrigel膠(人工基膜，含有IV型膠原和層黏連蛋白等成分)為Becton Dickison公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HEP-2喉鱗癌細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 采用MTT比色法。取對數(shù)生長期HEP-2細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。培養(yǎng)24 h使細(xì)胞完全貼壁。實(shí)驗(yàn)組分三組，分別加入含整合素αvβ3抗體10μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml 3 種濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，對照組培養(yǎng)液除不含整合素αvβ3抗體外，其余條件完全一致。培養(yǎng)3 d后，每孔加入MTT(5g/L)工作液10 μl培養(yǎng)4 h。取出，鏡檢可觀察到活細(xì)胞內(nèi)有顆粒狀藍(lán)紫色結(jié)晶，每孔加入100μl DMSO。然后以570 nm為測試波長，20 min內(nèi)在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取各孔光吸收度(A值)。腫瘤細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算:增殖抑制率(%)=(對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。

1.2.2 HEP-2喉鱗癌細(xì)胞中PCNA的表達(dá) 采用免疫組化SABC法。取HEP-2細(xì)胞，作細(xì)胞爬片。實(shí)驗(yàn)組分兩組，分別加入含整合素αvβ3抗體25μg/ml、50 μg/ml兩種濃度細(xì)胞培養(yǎng)液200μl，每種濃度做8個(gè)復(fù)孔，對照組培養(yǎng)液除不含整合素 αvβ3抗體外，其余條件完全一致。多聚甲醛固定20 min，蒸餾水洗滌，室溫干燥，－20℃保存，待測。PCNA免疫組化染色按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3 趨化液的制備 收集培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞即將長滿培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)的上清液即為趨化液。

1.2.4 Boyden 小室的制備［4］細(xì)胞培養(yǎng)池的多孔PET(Polyethylene Perephthalate)膜，將Matrigel基質(zhì)凝膠稀釋至300μg/mL，取100μL均勻涂抹一層于細(xì)胞培養(yǎng)池PET上表面。

1.2.5 細(xì)胞侵襲模型的建立 取對數(shù)生長期生長良好的HEP-2細(xì)胞消化后常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)液更換為分別含有0 μg/ml、10 μg/ml、25 μg/ml和50 μg/ml整合素αvβ3抗體的細(xì)胞培養(yǎng)液。分別取含不同濃度整合素αvβ3抗體培養(yǎng)液的HEP-2喉鱗癌細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液250μl，加入鋪好基質(zhì)凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)池中(Boyden小室的上室)，加入上述NIH3T3的條件培養(yǎng)液200μl，每種濃度做10個(gè)復(fù)孔。使細(xì)胞穿透Matrigel膠和PET膜上的微孔，達(dá)到PET膜下。

1.2.6 細(xì)胞固定、染色和侵襲細(xì)胞數(shù)的計(jì)算 將Boyden小室取出，用甲醇固定30 min，未結(jié)合型蘇木精染色10 min。在高倍鏡下計(jì)數(shù)PET膜下面侵襲的細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)中間和四周5個(gè)視野，得平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 整合素αvβ3抗體對HEP－2喉鱗癌細(xì)胞增殖的抑制作用(表1，圖1)

10 μg/ml、25μg/ml和50 μg/ml 3種不同濃度的整合素αvβ3抗體作用HEP-2喉鱗癌細(xì)胞后，測得的A值分別為 0.1687 ±0.0403，0.1194 ±0.0512 和0.0823 ±0.0338，與對照組(A 值為0.2135 ±0.0325)比較，差異有顯著性意義(P＜0.01)，測得的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率分別(23.56 ±3.36)%，(45.21 ±5.32)%和(68.27±4.49)%，與對照組相比亦有顯著性差異(P ＜0.01)，提示整合素 αvβ3 抗體可以顯著抑制HEP-2喉鱗癌細(xì)胞的生長，且增殖抑制率呈明顯的量效關(guān)系，結(jié)果表明整合素αvβ3對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

表1 各組A值及增殖抑制率情況±s)

表1 各組A值及增殖抑制率情況±s)

注:*為與對照組比較，P＜0.01;#為與實(shí)驗(yàn)Ⅰ組比較，P＜0.05;☆為與實(shí)驗(yàn)Ⅱ組比較，P＜0.05

組別 整合素αvβ3抗體濃度(μg/ml) A值 增殖抑制率(%)0.2135 ±0.0325 0實(shí)驗(yàn)Ⅰ組 10 0.1687 ±0.0403* 31.56 ±3.36*實(shí)驗(yàn)Ⅱ組 25 0.1194 ±0.0512*# 45.21 ±5.32*#實(shí)驗(yàn)Ⅲ組 50 0.0823±0.0338*#☆ 68.27±4.49*#☆對照組0

2.2 整合素αvβ3抗體對HEP－2喉鱗癌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響(圖2)

PCNA染色主要在胞核，陽性細(xì)胞染色表現(xiàn)為胞核呈棕黃色圓形顆粒狀。對照組HEP-2喉鱗癌細(xì)胞PCNA陽性染色明顯，實(shí)驗(yàn)組HEP-2喉鱗癌細(xì)胞PCNA陽性染色則明顯減弱。對照組PCNA表達(dá)的平均光密度值(average light density，ALD)為0.7223 ±0.0318，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組(25μg/ml)和實(shí)驗(yàn)Ⅱ組(50μg/ml)HEP-2喉鱗癌細(xì)胞PCNA表達(dá)的ALD值分別為0.45092±0.0436和0.2967±0.0625，與對照組(0 μg/ml)比較差異顯著(P＜0.01)，兩實(shí)驗(yàn)組間比較差異亦有顯著性意義(P＜0.05)，提示整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞的生長有抑制作用，劑量越大，抑制作用越強(qiáng)。

圖1 不同濃度整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞A值及增殖抑制率的影響

圖2 不同濃度整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

2.3 整合素αvβ3對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響(表 2，圖3)

不同濃度整合素αvβ3抗體處理的HEP-2喉鱗癌細(xì)胞，穿透細(xì)胞培養(yǎng)池PET膜的細(xì)胞計(jì)數(shù)見表2，結(jié)果表明整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞的侵襲能力有明顯抑制作用，且呈明顯量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接說明整合素αvβ3對喉鱗癌細(xì)胞的侵襲能力有促進(jìn)作用。

表2 不同濃度整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響(±s)

表2 不同濃度整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響(±s)

注:*為與對照組比較，P＜0.01;#為與實(shí)驗(yàn)Ⅰ組比較，P＜0.05;☆為與實(shí)驗(yàn)Ⅱ組比較，P＜0.05

41.36 ±5.87實(shí)驗(yàn)Ⅰ組 10 32.53 ±3.89*實(shí)驗(yàn)Ⅱ組 25 18.82 ±4.02*#實(shí)驗(yàn)Ⅲ組 50 13.71 ±2.94*#☆對照組0

圖3 不同濃度整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響

3 討論

喉鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞無限制的惡性增殖、大量的新血管生成和向周圍侵襲性生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其主要的惡性生物學(xué)行為。盡管目前對其外科手術(shù)、化療、放療和生物治療等相結(jié)合的綜合治療，但總觀其遠(yuǎn)期療效，仍不理想［5］。侵襲性生長及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉鱗癌療效不佳的主要原因。惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與細(xì)胞增殖和新血管形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中往往密不可分，且其與新血管生成具有共同的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，都依賴整合素、生長因子、細(xì)胞受體和細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同作用［6］。整合素αvβ3是整合素分子家族中重要的一員，可廣泛地表達(dá)于多種不同組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面，研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3且其表達(dá)水平與喉鱗癌的病理分級和組織學(xué)類型密切相關(guān);整合素αvβ3極可能對喉鱗癌的主要惡性生物學(xué)行為有促進(jìn)作用。體外的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ3在喉鱗癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和侵襲過程中起重要促進(jìn)作用。更多的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，整合素αvβ3對癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移和增殖能力有明顯的促進(jìn)作用［7，8］。

PCNA是僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)的DNA聚合酶的1種輔助蛋白，只有處于增殖周期增殖狀態(tài)的細(xì)胞才能檢測到PCNA的存在。PCNA表達(dá)水平的檢測是評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的1種常用方法。Boyden小室法是一種目前國際上應(yīng)用較為廣泛的體外快速細(xì)胞侵襲性模型。腫瘤細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟是穿過基膜，Boyden小室的原理就是通過在體外構(gòu)建人工基膜結(jié)構(gòu)，觀察上室細(xì)胞穿透人工基膜到達(dá)下室的侵襲能力來檢測腫瘤的侵襲性。

我們發(fā)現(xiàn)，10 μg/ml、25 μg/ml和50 μg/ml3種不同濃度的整合素 αvβ3抗體作用HEP-2喉鱗癌細(xì)胞72 h后，測得的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率分別為(23.56±3.36)%、(45.21 ±5.32)% 和(68.27 ±4.49)%，還發(fā)現(xiàn)整合素 αvβ3抗體能夠降低HEP-2細(xì)胞PCNA的表達(dá)水平，增殖抑制率和PCNA的表達(dá)水平均與整合素αvβ3抗體劑量呈明顯的量效關(guān)系，提示整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。在本研究Boyden體外細(xì)胞侵襲性模型中，我們發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ3抗體對HEP-2喉鱗癌細(xì)胞穿透細(xì)胞培養(yǎng)池多孔PET膜的能力有明顯抑制作用，并且它的這種作用呈劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接證實(shí)整合素αvβ3對喉鱗癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲性生長能力有正性調(diào)節(jié)作用。

整合素αvβ3促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞惡性增殖和侵襲性生長的具體作用機(jī)制很復(fù)雜，可能與其介導(dǎo)多種生長因子的激活及其與它們的受體相互作用有密切關(guān)系，還可能與其參與細(xì)胞因子或腫瘤誘導(dǎo)的新血管形成過程并直接影響到血管形成、生長和成熟有關(guān)［2，9］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移離不開腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和新血管生成，故整合素αvβ3通過上調(diào)細(xì)胞增殖和新血管生成促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的侵襲性生長。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，而作為細(xì)胞膜黏附受體的整合素αvβ3能與基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，從而促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。這也可能是整合素αvβ3促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞侵襲性生長的重要機(jī)制之一。

總之，本部分體外研究證實(shí)了整合素αvβ3對喉鱗癌細(xì)胞惡性增殖和侵襲性生長有重要的促進(jìn)作用。侵襲性生長更是導(dǎo)致喉鱗癌易復(fù)發(fā)和患者預(yù)后不佳的主要原因，但喉鱗癌的侵襲性生長離不開腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和新血管生成，且三者之間存在許多共同的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們更有理由認(rèn)為將整合素αvβ3作靶點(diǎn)治療喉鱗癌有充分的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有必要作更深入的研究和探索。

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