CD4、CD8、MSI表達與散發性結直腸癌預后關系的研究

周瑋蘆珊楊剛

我國結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢［1］，結直腸癌的治療仍以手術治療為主［2］，但仍有40%以上的患者5年內出現復發、轉移。目前推測預后的主要可靠依據為常規病理和臨床分期等，但用現代分子生物學理論來判斷腫瘤的惡性程度、轉移、復發的危險性，以補充病理和臨床分期的不足，更精確地判斷患者的預后是一非常有意義的課題［3］。

細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)是機體細胞免疫中重要的效應細胞，參與機體抗腫瘤作用，近來，人們又認識到CD4(+)T細胞在機體抗腫瘤免疫反應中的重要作用。CTL以表達CD8(+)的T淋巴細胞為主，大腸癌中有CD8(+)T淋巴細胞的局部浸潤者生存時間提高［4，8］。另外結直腸癌有微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)的表達［5］，有研究表明MSI(+)者預后好于MSI(－)者，且有癌腫較大、低分化等病理特點［6，7］，而此兩項特點卻與常規病理預后指標相矛盾。有研究認為MSI(+)結腸癌有癌腫內T淋巴細胞的浸潤，因此預后較好［8］，為此我們檢測了SCRC組織中CD4、CD8和MSI表達及與其預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本材料

標本取自南昌大學第二附屬醫院1999年1月至2000年3月手術切除的SCRC標本，共50例(經我院醫學倫理學委員會同意)。全部患者按阿姆斯特丹標準排除遺傳性結、直腸癌，符合SCRC標準;其中男性23例，女性27例，年齡29～81歲，平均年齡49.6歲。術前未經任何抗癌治療，均經病理學檢查確診。按pTNM病理學分期，Ⅰ期0例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期11例。其中區域淋巴結陽性37例，陰性者13例。癌旁組織為上述20例SCRC組織的陰性切緣組織。從原病歷中獲得癌細胞分化程度、淋巴結轉移、癌浸潤深度、腫瘤大小等臨床病理資料。同時根據上述資料按新版TNM分期標準重新進行TNM分期。

1.2 主要試劑

MAB-0021鼠抗人CD8單克隆抗體、即用型克隆系 C8/144B、Rev 021602鼠抗人CD4單克隆抗體、即用型克隆系4B12、封閉用正常山羊血清工作液、生物素標記二抗工作液和過氧化酶標記鏈霉素卵白素工作液均為福州邁新公司產品。2×Taq PCR Master Mix為北京天為時代科技有限公司產品。DNA Marker為北京天為時代公司產品。胰酶、DAB(Dialminobenzdine)顯色液、蛋白激酶K為美國Dako公司產品?；蚪MDNA提取試劑盒DP－303/304為北京天為時代科技有限公司產品。引物 BAT25、BAT26、D5S346、D17S261、D2S123為北京三博遠志生物技術有限公司產品。

1.3 免疫組織化學檢測

SP(streptavidin-peroxindase)法即過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素染色法［12］。以0.01 mmol/L PBS緩沖液取代一抗作陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。免疫組化步驟按說明書進行操作。

1.4 DNA 提取

在10μm厚的石蠟切片上采用顯微微切技術獲得腫瘤組織，并進行脫蠟處理，將組織打碎處理為細胞懸液，然后10 000 rpm離心1 min，倒盡上清，加200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮，然后按產品說明書操作，得到的基因組DNA在OD260處有顯著吸收峰。

1.5 PCR 步驟

各取cDNA產物2μl，待測凋亡相關基因和β-actin的正、反義引物各1μl(10μmol/L)，2×Taq-Mix 12.5 μl，加 ddH2O 6.5 μl，總反應體積 25 μl。反應條件:94℃ 3 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，38 個循環;結束前72℃延伸10 min。

1.6 結果判定標準

CD4和CD8主要表達于癌細胞的胞膜和胞質，為棕褐色顆粒。免疫組織化學染色切片在光鏡下計數。每張切片首先在100倍光鏡下觀察10個以上獨立視野，選取5個陽性細胞數最多的視野，然后換成400倍的光鏡進行計數，取5個視野計數的平均數。按文獻標準［8］，在400倍光鏡下CD4細胞陽性數＞40個定為CD4(+)，其余均為CD4(－);CD8細胞陽性數 ＞80個者定為CD8(+)，其余則定為CD8(－)。參與計數的病理科醫師對患者的臨床等其它相關信息不知。

MSI結果判定標準按美國國立癌癥研究所制定的標準進行:5個微衛星DNA標記中若有2個或2個以上出現MSI現象為MSI(+)，若僅有1個出現MSI現象為MSI(－)，如無出現MSI現象為MSS。由于MSI(－)和MSS的臨床特征相似，故本研究將此兩類合并為一組統計。

1.7 隨訪

采用電話隨訪及來院復診相結合方式，登記目前狀況、死亡時間、直接死亡原因、復發時間，計算無病生存期、累積生存率等。

1.8 統計學方法

采用卡方檢驗分析組間差異，應用Spearman等級相關檢驗分析相關性。采用Log Rank法比較存活率間的差異，同時采用SPSS10.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 SCRC、癌旁組織中CD4和CD8的表達情況

CD4、CD8陽性染色位于癌細胞的胞膜和胞質，癌旁組織切片中均無陽性染色。50例SCRC組織中CD4和CD8表達率均較相應的癌旁組織高，差異有顯著意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 SCRC和癌旁組織中CD4和CD8的表達情況(例，%)

2.2 CD4和CD8表達與術后生存率的關系

本組50例SCRC患者術后5年生存率為48%。按CD4和CD8表達強弱分組，CD4(+)和CD8(+)組術后5年生存率均高于CD4(－)和CD8(－)組，但無統計學意義(P＞0.05)。若將標本分成CD4/8(+/+)［CD4/8(+)］、CD4/8(+/－ )、CD4/8(－ /+)、CD4/8(－/－)四組，為統計方便將 CD4/8(+/+)表示為CD4/8(+)，將CD4/8(+)以外的CD4/8各種表達組合均統表示為CD4/8(－)。則CD4/8(+)組的5年累積生存率高于其余三組之和［即CD4/8(－)］，差異有顯著性(P ＜0.01)，見表2。

2.3 CD4、CD8表達與SCRC臨床病理特征的關系

有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、TNM分期與CD4/8(+/+)表達呈負相關關系(P＜0.01)，見表2。

2.4 SCRC 組織中 CD4、CD8表達與 MSI(+)的關系

本組50例 SCRC中MSI(+)者12例(24.0%)。CD4/8(+)表達中有62.5%為 MSI(+)，而 MSI(－)組中僅占 25.0%，差異有顯著性(P＜0.01)。經Spearman等級相關分析顯示，SCRC組織中CD4/8(+)表達與MSI(+)呈正相關關系(P＜0.01)，而與MSI(－)無相關性(P ＞0.05)，見表3。

表2 CD4/8表達與SCRC臨床病理特征的關系(例)

表3 MSI與CD4 CD8表達的關系(例)

3 討論

3.1 SCRC組織中的腫瘤浸潤淋巴細胞

腫瘤浸潤淋巴細胞(tumou-infiltrating lymphycyte，TIL)是一類由不同細胞構成的異質細胞群。腫瘤原發灶局部免疫細胞是防止腫瘤生長、發展的第一道防線。TIL可浸入腫瘤組織中，其抗腫瘤作用比循環淋巴細胞更直接，更準確地反映宿主－腫瘤相互作用的免疫應答狀態。細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是機體TIL細胞免疫中重要的效應細胞之一，CTL主要是表CD8T淋巴細胞，其主要功能是特異性殺傷靶細胞。腫瘤中CD8T淋巴細胞浸潤是有助于延長患者生存時間的獨立預后指標［9］，有研究認為成熟的T淋巴細胞除CD8T亞群外，還有CD4T淋巴細胞亞群，過去僅注意CD8T的抗瘤作用，近來開始逐漸認識到CD4T淋巴細胞在機體抗腫瘤免疫反應中的作用。有研究認為，CD8T細胞在CD4T細胞本身和其分泌的大量細胞因子輔助作用下殺傷腫瘤細胞，缺乏CD4T淋巴細胞是抗腫瘤免疫效應低下的原因［10，11］。本研究顯示 SCRC 中 CD4、CD8表達水平均高于正常組織，差別有統計學意義。雖然單獨CD4T(+)組或CD8T(+)組與相應的陰性組相比累計生存時間均更長，但其5年累積生存率差別沒有統計學意義，但若將CD4(+)、CD8(+)合并成為CD4/8(+)，而CD4/8(+/+)以外的CD4/8各種表達組合均統歸為CD4/8(－)加以統計，則CD4/8(+)組的5年累積生存率高于CD4/8(－)，差異具有顯著性。這提示CD4T可促進CD8T的抗癌效應。因而，對CD4T和CD8T細胞抗癌機制的深入研究對結直腸癌預后判定有一定的價值。

3.2 CD4、CD8表達與 MSI的關系

本組MSI(+)表達率為24%，與先前文獻報道相比稍高［12］，先前研究認為MSI(+)的結直腸癌預后較好，5年累積生存率高于MSI(－)。而MSI(+)的癌細胞組織分化低者較MSI(－)多見，此點與常規病理的預后相矛盾。目前對MSI(+)預后較好的原因尚不清楚，有學者認為與MSI(+)腫瘤突變負擔增加最終削弱了其生長能力及轉移潛能，另有學者認為與MSI(+)腫瘤引起機體更強的免疫反應有關［13］。然而，MSI(+)腫瘤局部是否有免疫細胞浸潤現象的不同還未見研究報道?本研究發現CD4/8(+)表達占MSI(+)組的62.5%，而在 MSI(－)組中僅占 25.0%，經Spearman等級相關分析顯示，SCRC組織中CD4/8(+)表達與MSI(+)具有相關關系，與MSI(－)不具有相關性。這提示MSI(+)的SCRC患者的預后較好的原因可能與癌腫局部的CTL免疫反應有關;從MSI(+)表型產生機制角度解釋，由錯配修復基因突變引起的MSI(+)組織中有大量的突變蛋白聚集，這些突變蛋白可作為外來抗原刺激機體的免疫系統產生免疫反應并參與抗腫瘤效應［13］。這也為腫瘤組織局部淋巴細胞浸潤的產生機制提供合理解釋。進一步研究MSI(+)中CD4T和CD8T產生的具體機制，如CD4T或CD8T是由哪個或哪幾個框移突變肽誘導而來的，從而作為SCRC免疫性靶抗原治療提供理論基礎。

3.3 MSI、CD4、CD8 與 TNM 分期的關系

TNM分期是目前主要臨床分期方法，但在預后判斷上也存在一些矛盾現象，應用分子生物學等方法來估計腫瘤的惡性程度，以補充TNM分期的某些不足，更準確地判斷預后，為進一步積極輔助治療提供依據。本研究發現，MSI表達與TNM分期無相關性，而CD4/8(+)與TNM分期有相關性。進一步對同一TNM分期患者生存差異分析發現，13例TNMⅡ期患者中7例存活超過5年，另外6例少于5年，其CD4/8(+)的表達率分別為57.1%和33.3%，差異有統計學意義。26例TNMⅢ期患者中9例存活超過5年，另外17例少于5年，其 CD4/8(+)表達率分別為 66.7%和23.6%，差異有統計學意義。此現象可能是目前臨床上常見的TNMⅢ期預后較TNMⅡ期好的原因所在，即MSI(+)導致抗腫瘤效應的CD4/8T細胞局部反應。

因而，本研究認為CD4/8(+)檢測可補充TNM分期的不足，特別是MSI(+)者，用于判斷預后，或者說可對TNM分期進一步細化，聯合TNM分期和CD4/8、MSI可更準確的判斷患者的預后，從而為隨后的綜合治療的制訂提供更準確的治療方案。

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