轉化生長因子β1+915 G/C基因多態性與大腸腺瘤及大腸癌的關系

余玉紅 陳出新 張 嘉

大腸腺瘤(colorectal adenoma)是大腸癌(colorectal carcinoma)的癌前期病變，80%以上的大腸癌由腺瘤惡變而來。從大腸腺瘤到癌的演變是由多基因參與的多階段、多步驟改變并積累的復雜過程。轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一組具有調節細胞生長和分化功能的多肽類細胞因子，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。目前認為，TGF-βl具有雙向作用:在腫瘤發生早期，抑制腫瘤細胞的生長;但在腫瘤的中后期，TGF-βl在腫瘤細胞中的高表達，可能促進腫瘤的惡性特征。TGF-βl基因具有多態性，其第25位氨基酸密碼子+915G/C多態性位于TGF-βl的信號肽區，與血清TGF-β1的濃度顯著相關［1］。鑒于TGF-βl在腫瘤免疫調節中的重要作用，我們把TGF-βl基因作為大腸腺瘤和大腸癌的易感候選基因來研究。本研究探討TGF-β1基因+915位點G/C多態性與大腸腺瘤及大腸癌易感性的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例組:52例散發型大腸腺瘤病例及70例散發型大腸癌病例來自深圳市各級醫院2007年1月～2009年8月經組織病理學確診的住院患者，其中大腸癌病例采血時未行放射和化學治療，分期標準采用Dukes改良分期。大腸腺瘤組男性28例，女性24例，平均發病年齡(43±12)歲。大腸癌組男性41例，女性29例，平均發病年齡(49±11)歲;其中結腸癌26例，直腸癌44例;組織學分型腺癌65例，黏液腺癌5例;Dukes分期A期14例，B期19例，C期20例，D期17例。對照組102例，來自深圳市第七人民醫院的健康體檢者，其中男性66例，女性36例，平均年齡(44±17)歲。以上研究對象均為無血緣關系的漢族人。該研究已經醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 基因分型

用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法分離基因組DNA。按照Amani等［2］方法，從基因組DNA中擴增包含+915位點多態性的TGF-β1基因片段。據文獻上游引物序列為5’GCTGCTACCGCTGCTGTGGC 3’，下 游 引 物 序 列 為 5’TGTTGTACAGGGCGAGCACGG 3’，由上海博亞生物技術有限公司合成。PCR反應總體積25μl，其中含滅菌雙蒸水18.5 μl，10×PCR 反應緩沖液2.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl，TaqDNA聚合酶0.5 μl，模板 DNA 1 μl(約30 ～100 ng)。PCR反應在GeneAmp 2 400 PCR儀(Perkin Elmer公司)上進行。反應條件94℃變性5 min后，94℃ 40 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個循環，最后 72℃延伸 5 min。擴增的DNA片段經2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察鑒定。限制性內切酶BglI(購自MBI)消化PCR產物。反應體系:PCR 產物10 μl，滅菌雙蒸水7.5 μl，10×限制性內切酶反應緩沖液2.0μl，與5 U限制性內切酶BglI，于37℃水浴5 h，65℃加熱10 min終止反應，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析基因型。

1.3 血清TGF-βl水平的檢測

用ELISA法測定血清TGF-β1水平。采用人TGF-β1測定ELISA試劑盒(美國R＆D公司產品，從深圳晶美生物工程有限公司購買)，收集血液，將血清凍存于－20℃的低溫冰箱。具體操作步驟如下:分別加入標準品及樣品各100μL，辣根過氧化物酶結合的TGF-β1 50μL，室溫孵育2 h，棄上清液，再加入顯色劑100 μL，室溫孵育30 min終止反應。酶標儀讀取A值。

1.4 統計學分析

以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認研究樣本的群體代表性，計算各組的基因型頻率及等位基因頻率。以χ2檢驗分析病例組和對照組TGF-β1基因型及等位基因分布的差異。以優勢比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(CI)表示相對風險度。P＜0.05認為有顯著性統計學意義。計量資料以均數±標準差±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為有顯著性統計學意義。統計在SPSS 11.5軟件包中進行。

2 結果

2.1 TGF-β1 基因型檢測結果

擴增的PCR產物約215 bp，用限制性內切酶BglI消化后，TGF-β1+915位點基因多態性共檢測到3種基因型，分別為 GG(175 bp和40 bp)、GC(215 bp、175 bp和40 bp)、CC(215 bp)，見圖1。其中40 bp片段較小，已移出膠外。經χ2檢驗，大腸腺瘤組，大腸癌組和正常對照組人群基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

圖1 TGF－β1擴增產物被BglI酶切后的電泳結果

2.2 TGF-β1+915位點基因多態性比較

我們比較了大腸腺瘤組，大腸癌組和正常對照組TGF-β1+915位點基因多態性分布，發現TGF-β1+915位點基因型頻率和等位基因頻率在各群體的總體分布無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 病例組和對照組TGF-β1基因+915位點G/C多態性分布

2.3 TGF-β1+915位點多態性與大腸腺瘤病變部位的關系

按病變部位將大腸腺瘤分為結腸腺瘤和直腸腺瘤后，未發現TGF-β1+915位點基因型頻率和等位基因頻率分布的差異(P＞0.05)，見表2。

表2 TGF-β1基因+915位點G/C多態性與大腸腺瘤病變部位的關系

2.4 TGF-β1+915位點多態性與大腸癌臨床病理特征的關系

大腸癌病例分別按病變部位、分化程度、Dukes分期等臨床病理特征分層后，未見TGF-β1+915位點基因型及等位基因頻率分布存在顯著性差異(P＞0.05)，見表3。在此基礎上我們進一步分析比較了不同性別的大腸癌患者TGF-β1基因型在以上幾種臨床病理特征中的分布，均未發現顯著性差異(P＞0.05)。

表3 TGF-β1基因+915位點G/C多態性與大腸癌臨床病理特征的關系

2.5 病例組和對照組TGF-β1血清水平的比較

與對照組比較，大腸腺瘤和大腸癌組血清TGF-β1水平顯著增高(分別 t=2.739，P ＜ 0.01;t=9.805，P＜0.01)，且大腸癌組血清TGF-β1水平顯著高于大腸腺瘤組(t=4.285，P ＜0.01)。Dukes D 期 TGF-β1 血清水平顯著高于Dukes A期(分別為 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。見表4。

表4 病例組和對照組TGF-β1血清水平比較

2.6 病例組各基因型間TGF-β1血清水平的比較

大腸腺瘤組和大腸癌組TGF-β1+915位點各基因型間TGF-β1血清水平無顯著型差異(P＞0.05)，見表5。

表5 病例組不同基因型間TGF-β1血清水平比較

3 討論

人類編碼TGF-βl的基因位于染色體19q13.1-3，其編碼區域由7個外顯子和6個內含子構成。目前發現TGF-βl基因至少存在9個單核苷酸多態性(SNPs)位點，它們的定位分別是-988(C＞A)、-800(G＞A)、-509(C＞T)、+72插入C、第4個內含子缺失c、第5個內含子內(C861-20T)、第10位氨基酸密碼子T869C(CTG ＞CCG，Leu＞Pro)、第 25位氨基酸密碼子G915C(CGG＞CCG，Arg＞Pro)、第263位氨基酸密碼子C1632T(ACC＞ATC，Thr＞Ile)。其中已有文獻報道［1，3，4］啟動子區-509(C ＞ T)、第 1 外顯子區第 10 氨基酸密碼子T869C(Leu＞Pro)、第25氨基酸密碼子G915C(Arg＞Pro)多態性的某些基因型與TGF-β1水平增高有關。

第25位氨基酸密碼子G915C多態性(rs1800471)位點位于第1個外顯子編碼的TGF-β1的信號肽區，信號肽序列的改變可能影響蛋白質的轉錄和翻譯，進而影響TGF-β1相關疾病的發生、發展和轉歸。Garcia-Gonzalez等［5］在142例西班牙胃癌患者中，未發現TGF-β1 G915C基因多態性與胃癌之間的相關性。Berndt等［6］對美國人的研究發現，－509TT和10Pro/Pro基因型與大腸腺瘤的高風險相關。其中－509TT基因型與多發性腺瘤及直腸腺瘤相關，而第25氨基酸密碼子G915C(Arg＞Pro)和第5外顯子區的第263氨基酸密碼子C1632T(Thr＞Ile)多態性與大腸腺瘤無關。我們采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法檢測了52例大腸腺瘤、70例大腸癌患者與102例正常對照者TGF-β1+915位點等位基因及基因型，總體分布未發現顯著性差異。與國外研究相似，表明TGF-β1+915G/C基因多態性與患大腸腺瘤及大腸癌的風險無關。

TGF-β1具有雙向作用:在腫瘤發生早期，TGF-β1起抑制作用，在腫瘤發生的后期TGF-β1則作為促癌因子直接作用于腫瘤細胞，通過刺激血管生成、增加瘤細胞與細胞外基質的相互作用以及抑制免疫系統等促進腫瘤的生長、浸潤及轉移［7］。大腸癌患者中TGF-β1血清水平增加且與腫瘤的分期或外科手術切除后的轉移相關［6］。我們分析比較了TGF-β1不同基因型的大腸癌患者臨床病理特征。不同性別、不同的病變部位、分化程度、Dukes分期等臨床病理特征中TGF-β1基因型及等位基因頻率分布無顯著性差異。表明+915G/C基因多態性可能與大腸癌的進展無關。我們同時采用ELISA法檢測了血清TGF-β1水平，發現大腸腺瘤組及大腸癌組血清TGF-β1水平顯著高于對照組。Dukes D期血清TGF-β1水平顯著高于Dukes A期(分別為 t=2.661，P=0.029)及 Dukes B 期(t=2.988，P=0.017)。可能的假說為:在腫瘤后期個體產生TGF-β1水平增高，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。我們進一步比較了TGF-β1+915位點各基因型間TGF-β1血清水平，未發現顯著型差異。表明TGF-β1血清水平可能與+915位點基因型無關。

我們檢測的樣本例數較少，尚需進一步擴大樣本檢測量，并完善TGF-β1其他多態性位點的檢測，從而明確TGF-β1基因型與TGF-β1分子表達的關系。

［1］ Tag CG，Mengsteab S，Hellerbrand C，et al.Analysis of the transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)codon 25 gene polymorphism by Light Cycler-analysis in patients with chronic hepatitis C infection〔J〕.Cytokine，2003，24(5):173.

［2］ Amani D，Dehaghani AS，Zolghadri J，et al.Lack of association between the TGF-β1 gene polymorphisms and recurrent spintaneous abortion〔J〕.JReprod Immunol，2005，68(1 ～2):91.

［3］ Eliopoulos DG，Mavroudi I，Pontikoglou C，et al.The-509C/T polymorphism of transforming growth factor-beta1 is associated with increased risk for developmentof chronic idiopathic neutropenia〔J〕.Eur JHaematol，2009，83(6):535.

［4］ Brezzi B，Del Prete D，Lupo A，et al.Primary IgA nephropathy ismore severe in TGF-beta1 high secretor patients〔J〕.J Nephrol，2009，22(6):747.

［5］ Garcia-Gonzalez MA，Strunk M，Piazuelo E，et al.TGFB1 gene polymorphisms:their relevance in the susceptibility to Helicobacter pylori-related diseases〔J〕.Genes Immun，2006，7(8):640.

［6］ Berndt SI，Huang WY，Chatterjee N，et al.Transforming growth factor beta 1(TGFB1)gene polymorphisms and risk of advanced colorectal adenoma〔J〕.Carcinogenesis，2007，28(9):1965.

［7］ Bruckheimer EM，Kypfianou N.Bcl-2 antagonizes the combined apoptotic effect of transforming growth factor-βand dihydrotestosterone in prostate cancer cells〔J〕.Prostate，2002，53(2):133.