氯沙坦對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響△

四川瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科(瀘州 646000) 陳書琴 杜 娟 朱紅楓

近年來的研究證實,心力衰竭(Heart failure,HF)是心血管疾病的終末階段的臨床表現(xiàn),心肌細(xì)胞凋亡是 HF發(fā)生發(fā)展的一個重要的病理生理基礎(chǔ),通過阻斷、干預(yù)凋亡去治療 HF的認(rèn)知得到迅速發(fā)展。王志堅等[1]研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血漿 ET-I、AngⅡ濃度明顯升高,氯沙坦具有降低 ET-1的作用。本實驗通過建立心力衰竭模型,采用 TdT介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)判定心肌細(xì)胞凋亡,并采用免疫組化方法研究心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白 Bax、Bcl-2的表達(dá),探討氯沙坦對心力衰竭時心肌細(xì)胞凋亡的影響及其在積極逆轉(zhuǎn)心肌受損,改善心衰進(jìn)程中的作用。

材料與方法

1 動物與試劑 8周齡健康、雄性 SD大鼠 24只由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供;鹽酸阿霉素(Adriamycin,ADR)由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),氯沙坦由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn);TUNEL試劑盒(原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒)為德國 Roche公司生產(chǎn);Bax試劑盒,Bcl-2試劑盒,DAB顯色劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制作 將 24只大鼠隨機(jī)分為 3組:對照組、心衰組、氯沙坦干預(yù)組各 8只。參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》將鹽酸阿霉素粉針用滅菌注射用水溶解,心衰組:腹腔注射 ADR(4 mg/kg,每周 1次,共 6周,累積總量 24 mg/kg;氯沙坦干預(yù)組腹腔注射 ADR 4 mg/kg,同時每天給氯沙坦 20 mg/kg灌胃,對照組:注射相同體積的注射用水。

2.2 心肌石蠟切塊的制備 末次給藥 24 h,取出心臟洗凈固定 12 h,二甲苯透明,石蠟包埋,切片用以檢測心肌細(xì)胞凋亡及 Bax與 Bcl-2基因的蛋白表達(dá)檢測。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測 用 TUNEL法,按試劑盒說明操作,以細(xì)胞核被染成棕褐色為陽性結(jié)果。每個標(biāo)本觀察凋亡陽性細(xì)胞,計算平均陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。按公式:凋亡指數(shù)(AI):凋亡細(xì)胞核數(shù) /總細(xì)胞核數(shù)計算。

2.4 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測 石蠟切片脫蠟水化,PBS漂洗,滴加正常羊血清室溫下封閉,棄去羊血清,滴加一抗;PBS漂洗,滴加生物素化二抗(1∶100);PBS漂洗,鏈霉素-生物素化 HRP復(fù)合物(1∶100);PBS漂洗,Tris-HCl緩沖液漂洗,DAB顯色后漂洗;蘇木素淡染,脫水,透明,中性樹膠封片,鏡檢。陰性對照以 PBS代替一抗孵育,其他步驟相同;陽性對照用已知的陽性標(biāo)本。

2.5 計算機(jī)圖像分析 用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(IPP6.0)進(jìn)行定量分析,測定陽性染色的平均光密度(MOD)與陽性細(xì)胞百分比(指陽性細(xì)胞占視野中所有細(xì)胞數(shù)的百分比),分析心肌組織中 Bcl-2,Bax蛋白陽性染色面積百分?jǐn)?shù)。蛋白陽性表達(dá)指數(shù)(PEI):PEI(%)= MOD×陽性細(xì)胞百分比×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 各組之間指標(biāo)的比較用SPSS13.0軟件包進(jìn)行秩和檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果 見表 1。對照組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均比其他各組低,而心衰組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較氯沙坦干預(yù)組高,提示氯沙坦有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較(±s)

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01;與心衰組比較,△P＜0.01

組 別 n 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)對照組 8 0.92±1.64心衰組 8 22.28±5.32*氯沙坦干預(yù)組 8 13.49±7.45△H值 19.86 P值 0.000

2 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達(dá)結(jié)果 見表 2。心衰組和氯沙坦干預(yù)組心肌細(xì)胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.01),與心衰組相比,氯沙坦干預(yù)組明顯下調(diào) Bax基因表達(dá),上調(diào) Bc1-2基因表達(dá)(P ＜0.01)。

表2 各組心肌細(xì)胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達(dá)的PEI比較 (± s)

表2 各組心肌細(xì)胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達(dá)的PEI比較 (± s)

注:*與對照組比較,P＜0.01;△與心衰組比較,P＜0.01

組 別 n Bax Bc1-2對照組 8 0.53± 0.07 0.69± 0.11心衰組 8 17.92± 9.81* 5.39± 0.64*氯沙坦干預(yù)組 8 8.32± 11.06△ 10.49± 7.59△H值 18.24 18.17 P值 0.000 0.000

討 論

實驗研究[2]發(fā)現(xiàn):ADR具有嚴(yán)重的心臟毒性作用,采用連續(xù)腹腔注射 ADR,可使心肌細(xì)胞變性壞死,降低心功能并出現(xiàn) CHF。本實驗研究表明,心衰組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組升高,證明了 HF時心肌細(xì)胞存在凋亡。而氯沙坦干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比心衰組降低,這表明氯沙坦具有降低心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)HF的作用。與陳源源等[3]報道結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控,這一過程受多種促凋亡和抗凋亡的蛋白調(diào)節(jié),其中促凋亡基因 Bax和凋亡抑制基因 Bc1-2被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[4],張光謀等[5]報道 Bcl-2和 Bax基因參與了心肌肥大心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bc1-2它可抑制多種因素如氧自由基和 p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。Bax為促凋亡因子,其過度表達(dá)將加速由白細(xì)胞介素-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)觸發(fā)因素存在時,Bcl-2/Bax的比值決定著細(xì)胞是存活或是死亡。心肌細(xì)胞凋亡是心衰從代償走向失代償?shù)霓D(zhuǎn)折點[7]。

實驗研究表明 AngⅡ可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[8],在AngⅡ引起細(xì)胞凋亡的過程中有較多的信號通路參與。已經(jīng)證實 AngⅡ的主要心血管生物效應(yīng)由 AT1受體介導(dǎo),通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑刺激 Bax的表達(dá),抑制 Bcl-2表達(dá),細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化增加,最終激活細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶和 Caspase蛋白酶,使細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,AT1R拮抗劑不僅具有血液動力學(xué)效應(yīng),還可能通過抑制 AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[9]。

氯沙坦為新型血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ拮抗劑,在本試驗中氯沙坦干預(yù)組通過阻滯 AngⅡ的促凋亡作用,顯著抑制了心肌細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果提示:氯沙坦干預(yù)組比心衰組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低,同時對抑凋亡基因和促凋亡基因具有雙向調(diào)節(jié)的作用,能上調(diào)抑凋亡基因 Bcl-2蛋白的表達(dá),下調(diào)促凋亡基因 Bax蛋白的表達(dá),從而抑制或阻斷心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。說明氯沙坦抑制心肌細(xì)胞凋亡能逆轉(zhuǎn)心肌受損,改善心衰進(jìn)程,這可能是氯沙坦防治心力衰竭的分子作用機(jī)制之一。

綜上所述,氯沙坦能通過拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌、抑制血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)凋亡基因 Bc1-2、Bax的表達(dá),為氯沙坦治療心力衰竭的機(jī)制提供了最直接的證據(jù)。在凋亡的早期[10],阻斷線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,可以抑制或逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、改善心功能、延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

[1] 王志堅,杭 娟.氯沙坦對心力衰竭患者血漿內(nèi)皮素-1和降鈣素基因相關(guān)肽的影響 [J].中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志,2006,3(5):501-503.

[2] 楊建業(yè),張迎春.阿霉素誘導(dǎo)大鼠心衰模型的建立.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,24(5):269-271.

[3] 陳源源,孫寧玲.纈沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠心肌凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)的影響 [J].高血壓雜志,2004,12(2):151-155.

[4] Chen C,Cui J,Lu H,et al.Modeling of the role ofa Baxactivation switch in the mitochondrial apoptosis decision[J].Biophys,2007,92(12):4304-4315.

[5] 張光謀,許重潔,王興平,等.心肌肥大大鼠心肌細(xì)胞凋亡與 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009,38(4):396-411.

[6] Zhou J,Luo RB,Tang CF,et al.Efect of Bcl-2 protein family and p53 gene on regulating and controlling cell apoptosis[J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Linchuang Kangfu,2007,11(10):1950-1952.

[7] 胡大一,馬長生.心臟病學(xué)實踐-新進(jìn)展與臨床案例.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:61-62.

[8] Schmidt-OttKM,KagiyamaS,Ianphillips M.The multiple actions of angiotensin II in atherosclerosis[J].Peptides,2000,93(1):65-77.

[9] 榆 華,遲路湘.血管緊張素Ⅱ /l型受體拮抗劑對心肌細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制[J].中國分子心臟病學(xué)雜志,2008,8(2):83-86.

[10] Khoynezhad A.Promising aspects and caveats of studies on anti-apoptotic therapies in patients with heart failure[J].Eur J Heart Fail,2007,9(2):120-123.