藜草花粉特異性致敏哮喘動物模型的制備

西安交通大學醫學院第二附屬醫院呼吸內科(西交 710004)

王勝昱* 孫秀珍 盧家美 張 明 吳媛媛

支氣管哮喘是全球范圍內最常見的慢性呼吸道疾病,無地域和種族的局限性,也無年齡和性別的差異。它具有慢性反復發作的特點,嚴重者可危及生命。然而由于支氣管哮喘的發病機制復雜,并且相關研究涉及到人體時會受到種種限制,因此有關病因的確定、發病機制的探索、新治療方法的評價、新藥的研究與開發在相當程度上均需要通過動物實驗進行,故制備哮喘動物模型可在一定程度上達到研究目的。從氣傳致敏花粉種類中調查發現,藜草是我國許多地方夏秋季節大氣中最常見的氣傳致敏花粉之一[1]。孫秀珍等[2]研究發現哮喘患者藜草花粉 ID及 sIgE陽性率在 40%以上。因此,構建藜草花粉致敏的哮喘動物模型為今后研究藜草花粉過敏性哮喘的發病機制和探索新的治療手段打下基礎。

材料與方法

1 動物與試劑 清潔級健康 BALB/c小鼠 40只,3～4周齡,雌性,體重 16±2g,購于西安交通大學醫學院實驗動物中心,按隨機數字法分為:①空白對照組、②低劑量組、③中劑量組、④高劑量組,每組 10只,并用苦杏仁酸標記。藜草花粉由本實驗室采摘并保存;氫氧化鋁凝膠有本實驗室自制;IL-4、IFN-γ、IgE、IgG1(ELISA)檢測試劑盒購于西安沃爾森生物技術有限公司。

2 藜草花粉粗制變應原誘導小鼠肺部變態反應模型的的建立 空白對照組腹腔注射 PBS100 μ l加氫氧化鋁 2mg,低劑量組腹腔注射 100 μ g/100 μ l藜草粗制變應原加氫氧化鋁 2mg致敏,中劑量組腹腔注射200 μ g/200 μ l藜草粗制變應原加氫氧化鋁 2mg致敏,高劑量組腹腔注射 300 μ g/300 μ l藜草粗制變應原加氫氧化鋁 2mg致敏。第 9、17天后加強致敏方法劑量同前。在第 25天空白對照組用 PBS代替變應原滴鼻激發 ,低劑量組采用 100 μ g/10 μ l藜草變應原激發 ,中劑量組采用 200 μ g/20 μ l藜草變應原激發,高劑量組采用300 μ g/30 μ l藜草變應原激發 ,每天 1次 ,連續 3d。最后1天滴鼻后 24h進行以下檢查。

3 氣管肺泡灌洗(BAL)及取血 小鼠麻醉后,眼窩取血,收集到 Eppendorf管中,3000 rPmin離心20 min,血清轉移到另一個干凈的 Eppendorf管中,-20℃保存。氣管切開和氣管插管,注入 PBS 0.4ml,灌洗 3～ 4次,灌洗液回收率＞ 80%。 BALF經900rPmin離心 10min后,在 1 h內作細胞分離,上清液于-20℃儲存,作細胞因子測定。

4 BALF中細胞總數、細胞分類 取離心后的沉淀細胞,用 PBS洗兩次,稀釋成 1 ml懸液,將細胞懸液混勻后加入血細胞計數板,顯微鏡下進行細胞計數。另取 0.2ml于潔凈光滑載玻片上涂片,以瑞氏染液染色,光學顯微鏡下進行細胞分類,數 300個細胞,求出各類細胞的百分比。

5 BALF中 IL-4的濃度測定 IL-4的測定按ELISA試劑盒說明書進行。即每孔加入標準品稀釋液或待測樣品 100 μ l,將反應板充分混勻后置 37℃孕育120min,用洗滌液洗板 4～6次,向濾紙上印干。加入酶標抗體工作液 100 μ l,將反應板充分混勻后置 37℃孕育 30min,洗滌液洗板 4～ 6次,加入底物工作液100 μl,置 37℃暗處反應 15min,加入 100 μl終止液終止反應,30min內用酶標儀在 450nm處測吸光值。所有OD值都應減除空白值后再行計算。以標準品 2000、1000、 500、 250、 125、 62.5、 31.2、 0 pg/ml為橫坐標 ,OD值為縱坐標,在坐標紙上作圖,畫出標準曲線。根據樣品 OD值在該曲線圖上查出相應 IL-4含量。

6 BALF中 IFN-γ的濃度測定 IFN-γ的測定按 ELISA試劑盒說明書進行。即每孔加入標準品稀釋液或待測樣品 100 μ l,將反應板充分混勻后置 37℃孕育 120min,用洗滌液洗板 4～6次,向濾紙上印干。加入酶標抗體工作液 100 μ l,將反應板充分混勻后置37℃孕育 30min,洗滌液洗板 4～ 6次,加入底物工作液 100 μ l,置 37℃暗處反應 15 min,加入 100 μ l終止液終止反應,30min內用酶標儀在 450nm處測吸光值。所有 OD值都應減除空白值后再行計算。以標準品2000、1000、500、250、125、 62、31、0 pg/ml為 橫坐標 ,OD值為縱坐標,在坐標紙上作圖,畫出標準曲線。根據樣品 OD值在該曲線圖上查出相應 IFN-γ含量。

7 肺組織學檢查 打開胸腔,分離并取下肺組織,進行病理組織學檢查。肺臟再以 10%中性甲醛灌注固定 24h,石蠟包埋,常規切片,進行支氣管、肺組織HE染色,以檢測肺組織炎癥細胞浸潤;根據Underwood的標準對肺組織炎癥細胞浸潤評分,根據血管周圍和氣道周圍細胞浸潤情況不同分為 0～ 5分。

8 血清中特異性 IgG11mg/ml的變應原粗浸液用 pH9.6的包被液稀釋至終濃度為 10 μ g/ml,加入100 μl/孔到 96孔板中,4℃過夜。 用 PBST(含 0.05%tween)洗板 5次 ,加入封閉液 100 μ l/孔 ,37℃孵 育120min,再用 PBST洗板 5次。將各組小鼠血清按一定比例稀釋,分別加入 100 μ l/孔已包被粗制變應原的 96孔酶標板中,37℃孵育 120min,用 PBST洗液洗板 5次,每孔加入已稀釋的 HAM A-Ig G1(1∶2000),37℃孵育 120min,PBST洗板 5次,加入含 0.5mg/ml鄰苯二胺(OPD)的磷酸-檸檬酸緩沖液,37℃避光顯色20min,加入終止液終止反應,30min內用酶標儀在450nm處測吸光值。

9 血清中特異性 IgE 1mg/ml的變應原粗浸液用 pH9.6的包被液稀釋至終濃度為 10 μ g/ml,加入100 μl/孔到 96孔板中,4℃過夜。 用 PBST(含 0.05%tween)洗板 5次 ,加入封閉液 100 μ l/孔 ,37℃孵 育120min,再用 PBST洗板 5次。將各組小鼠血清按一定比例稀釋,分別加入 100 μ l/孔已包被粗制變應原的 96孔酶標板中,37℃孵育 120min,用 PBST洗液洗板 5次,每孔加入已稀釋的 HAM A-IgE(1∶1000),37℃孵育 120min,PBST洗板 5次,加入含 0.5mg/ml鄰苯二胺 (OPD)的磷酸-檸檬酸緩沖液,37℃避光顯色20min,加入終止液終止反應,30min內用酶標儀在450nm處測吸光值。

10 脾組織勻漿 IL-4和 IFN-γ的產生 將處死的免疫小鼠浸入 75%乙醇中消毒 2～3s,置超凈臺,再次局部消毒皮膚,無菌條件下摘脾,并依次在 4°條件下研磨、PBS沖洗、用 RIPA裂解液裂解,并在 4°下4000r/m離心 10min,取勻漿液上清。用 ELISA方法測定 IL-4和 IFN-γ,方法同前。

結 果

1 肉眼觀察 空白對照組小鼠體重較前增加,食欲 精神好,皮毛光亮,眼睛明亮,大小便正常,無死亡。致敏小鼠后普遍煩躁,聚集成堆,活動減少,可看見腹式呼吸,并且隨著劑量增加小鼠反應明顯強烈,1～2d后恢復正常。在高劑量組中有兩只小鼠死亡。

2 病理變化 見表 1及圖 1～5。小鼠肺組織炎癥病理評分按低、中、高劑量組依次增高。低、中、高劑量組模型組與空白對照組比較,血管周圍和氣管周圍存在明顯的炎癥細胞浸潤。高劑量組小鼠支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有明顯的炎癥細胞浸潤,以巨噬細胞和嗜酸性粒細胞為主,大量炎癥細胞向小支氣管和血管遷移,上皮細胞部分有脫落,肺泡內有水腫,且有黏液上皮化生。中、低劑量組中炎性細胞數量及其分類明顯低于高劑量組。而空白對照組氣管結構無明顯改變,小鼠支氣管黏膜上皮 黏膜肌層基本完好,支氣管管腔規則,周圍無炎癥細胞浸潤。

表1 小鼠肺組織病理評分(分)

3 BALF中細胞學變化 見表 2。 BALF以巨噬細胞為主,低、中、高劑量組中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞、及淋巴細胞比例均明顯高于空白對照組(P＜0.05)。表明藜草花粉可誘導氣管炎癥反應。

4 BALF中 IL-4和 IFN-γ的測定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發后,BALF中IL-4含量明顯升高,而 IFN-γ明顯下降,(P＜0.05)。提示 BALF中 Th2型細胞因子產生,抑制 Th1型細胞因子分泌。

5 血清中特異性 Ig E和 Ig G1測定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發后,小鼠產生抗原特異性 IgE和 IgG1,與空白組相比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明藜草花粉粗制變應原能誘導小鼠產生特異性 Ig E和 IgG1。

6 脾組織勻漿 IL-4和 IFN-γ的測定 與空白組相比較,低、中、高劑量組小鼠在致敏激發后,脾組織中IL-4含量明顯升高,而 IFN-γ明顯下降(P ＜0.05)。表明藜草花粉粗制變應原能誘導小鼠脾臟產生 Th2型細胞因子,抑制 Th1型細胞因子分泌。

表2 肺泡灌洗液中細胞學改變

討 論

支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細胞浸潤為主的慢性氣管炎癥性疾病。引起氣管炎癥的是由肥大細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和上皮細胞等多種炎癥細胞以及 50余種炎癥介質和細胞因子共同參與、相互作用的結果。盡管近年來對支氣管哮喘的研究已進入分子和細胞水平,國際上對其防治也制定了規范化指導文件,但全球許多國家和地區哮喘的患病率和病死率均呈上升趨勢。

目前已制備出多種變應原的動物模型。 Huston等[3]首先用 OVA制成豚鼠吸入致敏的哮喘模型。Carvalho等[4]在大鼠皮下接種熱凝結的 OV A小片段,2～ 3周后用聚合 OV A氣管內激發。這一方法不用佐劑,不需加強免疫,能夠產生發作期氣管高反應性(AHR)并誘導持續的氣管 EOS浸潤和活化,且具有類似人類哮喘的 Th2獨特型的肺組織病理學改變,其缺點是不具備哮喘患者在非發作期持續的 AHR。Carr等[5]給麻醉狀態下的小鼠鼻內接種 15 μ l包含1000EID50的 A型流感病毒,接種 4d后觀察到氣管內有多種炎癥細胞聚集,并可見氣道上皮細胞廣泛變性。Konno等[6]給 BALB/C小鼠氣管內滴注 LPS發現支氣管平滑肌對乙酰膽堿的反應性顯著升高。Ray等[7]將豚鼠在麻醉狀態下行氣管插管,給予 CO2機械過度通氣發現氣管阻力增加,肺動態順應性下降。我國研究者遲磊等[8]則另辟奚徑,在大鼠兩側腹股溝、腹、前足趾皮下注射 OVA成功地建立大鼠支氣管哮喘模型。另有郝敏麒等[9]將屋塵螨 Dep1和 Dep2用 PBS稀釋為 1g/L從而用較少量的螨取液建了 BALB/c小鼠塵螨支氣管哮喘模型。

小鼠的免疫及遺傳背景較為清楚,品系純正,可用于小鼠的免疫學及分子生物學試劑來源廣泛齊全。小鼠本身的價格相對低廉,所需試劑的量相對較少,易于喂養,操作方便且一個人可獨立完成。因此,實驗中使用小鼠變應性疾病的模型越來越多。不同品系小鼠對OVA的免疫反應亦不同,BALB/c小鼠致敏后可產生高滴度的 IgE,C57BL/6小鼠只產生低滴度的IgE[10]。本實驗選用了 BALB/c小鼠構建哮喘模型,通過對小鼠腹腔注射和滴鼻激發不同劑量藜草花粉粗制變應原,從肺組織病理變化結果發現小鼠肺組織變態反應炎癥逐漸加重,巨噬細胞和嗜酸性粒細胞隨抗原劑量增加而增加,表現為氣管和血管周圍出現大量的炎癥細胞浸潤。BALF中細胞學變化顯示:小鼠 BALF存在大量炎癥細胞,巨噬細胞和嗜酸性粒細胞隨抗原劑量增加而增加,其病理變化與人類過敏性哮喘的病理變化有一定相似。

此外我們在研究中也發現個別老鼠肺部炎癥反應不明顯,支氣管肺泡灌洗液中細胞分類嗜酸性粒細胞不高,可能與老鼠周齡在入組時偏差有關。黃華瓊等[11]研究證實小鼠越在生命早期經過敏原激發,肺部炎癥和氣管高反應性越容易產生;而周齡過大的小鼠肺部炎癥反應則不明顯。支氣管哮喘的特征是 Th1型淋巴細胞反應與 Th2型淋巴細胞反應的失衡。 Th1型淋巴細胞主要分泌 IFN-r等細胞因子,Th2型淋巴細胞主要分泌 IL-4,IL-5等細胞因子。Th2型細胞因子分泌增多,誘導嗜酸性粒細胞聚集,合成 IgE抗體增多,使 Th1型淋巴細胞應答受到抑制。在我們的研究中,高劑量組的脾組織勻漿與肺泡灌洗液中 IL-4明顯高于其他組,而 IFN-r卻顯著降低;血中特異性 Ig E和 IgG1顯著上升均表明藜草花粉粗制變應原成功誘導 Th2型淋巴細胞反應。本實驗通過制備藜草花粉粗制變應原,腹腔注射與滴鼻激發兩種方式成功構建 BALB/C小鼠變態反應氣管炎癥動物模型,必將會對以后研究藜草花粉所致過敏性哮喘的發病機制、病理生理及其免疫治療打下基礎。

(本文圖片見封3)

圖1 高劑量組小鼠肺組織內有明顯炎細胞浸潤(HE×400)

圖2 高劑量組小鼠肺組織內可見肺泡內水腫(HE×100)

圖3 高劑量組小鼠肺組織內可見上皮化生(HE×400)

圖4 中劑量組炎性細胞明顯低于高劑量組(HE×400)

圖5 低劑量組炎性細胞浸潤明顯低于高劑量(HE×100)

圖6 對照組小鼠肺內結構完好,無炎性細胞浸潤(HE×100)

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