血漿必需氨基酸濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)性分析

王慧俐, 邱 齡, 李艷芳 (山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科, 太原 030001)

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個(gè)凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制,這一過程在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用[1]。自噬的消長(zhǎng)受多因素的影響,饑餓、胰高血糖素可以誘導(dǎo)自噬;胰島素抑制自噬。他們的作用點(diǎn)在于影響血漿氨基酸的水平,當(dāng)氨基酸水平降低時(shí)自噬啟動(dòng),相反自噬被抑制[2]。但不同氨基酸對(duì)細(xì)胞自噬程度的影響,目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)較少。本實(shí)驗(yàn)采用定期饑餓大鼠誘導(dǎo)自噬,一定時(shí)期后檢測(cè)血漿必需氨基酸濃度和肝臟細(xì)胞自噬程度做相關(guān)性分析,以探討哪些血漿必需氨基酸的濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)性大,為今后誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞自噬的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為細(xì)胞自噬在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng),包括四元泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、柱溫箱,HP化學(xué)工作站;透射式電鏡(日本日立 HITACHI公司 H-600);超薄切片機(jī)(瑞典 LKB公司LKB-Ⅴ )。

8種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品[蘇氨酸 (Thr)、色氨酸(Trp)、異亮氨酸 (Ile)、亮氨酸 (Leu)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸 (Met)、苯丙氨酸 (Phe)、賴氨酸(Lys)]購自 Sigma公司;甲醇、乙腈為 HPLC,三乙胺、四氫呋喃、醋酸鈉均為分析純,購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;硼酸、鄰苯二甲醛、巰基乙醇(上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝);24月齡 SD雌性大鼠,體重 320-470g(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及取材 大鼠 30只自由飲食洗脫2周,飼料為全價(jià)顆粒料(主要營(yíng)養(yǎng)成分:粗蛋白19.31%、粗脂肪 2.9%、粗纖維 3.1%、水分 8.7%、鈣 0.5%、磷 0.5%),2周后按體重隨機(jī)分為 A組(正常飲食對(duì)照組)、B組(1 d自由飲食 1 d禁食)、C組(5 d自由飲食 2 d禁食)3組(每組 10只)。普通環(huán)境飼養(yǎng),飼料同上,溫度 20-24℃,濕度55%-80%,自然光照,飲用自來水,每周換墊料 2次。飼養(yǎng) 5個(gè)月后,于 B組和 C組均應(yīng)禁食當(dāng)天清晨取標(biāo)本。25%的烏拉坦麻醉大鼠后暴露肝臟,快速剪下一小塊肝臟組織在預(yù)冷的固定液30 s內(nèi)切成1 mm3大小的組織塊,置于 2%的戊二醛固定液 2 h后緩沖液沖洗后浸泡,4℃保存?zhèn)溆?。垂直心臟進(jìn)針采血 2 m l,抗凝后室溫靜置 10min,采用離心機(jī)加速紅細(xì)胞沉淀(3 000 r/min,15min),取 500μl上清液加入等體積乙腈混勻室溫靜置 10 min充分沉淀血漿中的蛋白質(zhì),然后 15 000 r/min離心 10 min,取上清液,-70℃保存待測(cè)。

1.2.2 高效液相色譜法檢測(cè)血漿氨基酸含量

1.2.2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液制備 用 0.1 mol/L的 HCl制成含每種氨基酸濃度為 0.125,0.25,1.25,2.5μmol/m l的 4種混合氨基酸儲(chǔ)備液,4℃冰箱保存。

1.2.2.2 鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑的制備20mg OPA以 5ml甲醇溶解,加入 50μl巰基乙醇,混勻,4℃冰箱保存,3 d內(nèi)使用。

1.2.2.3 色譜條件 SinoChrom ODS-BPC18色譜柱(5μm,250 mm×4.6mm,大連伊利特公司);流動(dòng)相 A液為 0.02mol/L醋酸鈉(pH7.2)-四氫呋喃-三乙胺(99∶1∶0.1),流動(dòng)相 B為甲醇-乙腈-0.02 mol/L醋酸鈉(pH 7.2)(175∶225∶100);梯度程序以純 A液開始,遞增 B液百分比,具體增幅如下:0 min,100%A;17 min,50%B;19 min,50%B;21 min,100%B;21.5 min,100%B;22 min,100%A。流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 338 nm,柱溫 25℃。

1.2.2.4 測(cè)定 取不同濃度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 20μl,加 OPA試劑 40μl,硼酸緩沖液(pH 8.5)180μl,充分混勻后,室溫進(jìn)行衍生化反應(yīng) 10min后,0.45μm濾過膜濾過取 20μl進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度對(duì)峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出 8種氨基酸的線性回歸方程,以此對(duì)未知樣品定量分析。依上述方法對(duì)各種血漿樣品逐一測(cè)定,經(jīng)線性方程計(jì)算得出樣品中各種氨基酸的含量。

1.2.3 透射電鏡觀察肝細(xì)胞自噬泡 經(jīng)過常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為 50 nm)、醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電鏡觀察、拍照、記錄。采用 Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算電鏡照片中各個(gè)細(xì)胞中自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比例。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿氨基酸測(cè)定

2.1.1 氨基酸類型的確定 采用高效液相色譜法檢測(cè)血漿氨基酸含量結(jié)果見圖 1。

2.1.2 氨基酸的濃度 B組和 C組中的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度較 A組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他氨基酸三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 細(xì)胞自噬的檢測(cè)

2.2.1 電鏡觀察 A組肝臟細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,核仁明顯;脂滴較多,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布在細(xì)胞質(zhì),自噬溶酶體少見。B組肝臟細(xì)胞核內(nèi)染色體輕度凝集、邊聚,核仁可見,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,腫脹明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,自噬溶酶體數(shù)量較多。C組肝臟細(xì)胞核圓形,核內(nèi)染色質(zhì)輕度邊聚,線粒體豐富,線粒體輕度腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,自噬溶酶體較多。自噬泡為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞質(zhì)成分或廢棄的細(xì)胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu) (見圖2)。

圖1 8種必需氨基酸的 HPLC圖譜(0.25μmol/ml)Fig 1 HPLC chromatograms of essential amino acids(0.25μmol/m l)

表1 不同組大鼠血漿必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

表1 不同組大鼠血漿必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

與 A組比較,*P＜0.01,**P＜0.001

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圖2 各組大鼠肝臟細(xì)胞自噬透射電鏡觀察及典型自噬泡Fig 2 The autophagy of rat hepatocytes and the typicalautophagosomes under TEM

2.2.2 自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值 經(jīng) Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞電鏡照片中自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值,結(jié)果顯示:B組(0.029 2±0.018 8)和 C組 (0.045 2±0.019 6)均較 A組(0.008 9±0.004 1)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);B組和 C組兩者之間該比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 血漿氨基酸濃度與細(xì)胞自噬程度的關(guān)系 采用 Spearman秩相關(guān)計(jì)算血漿氨基酸濃度和自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值的相關(guān)性,結(jié)果顯示纈氨酸與細(xì)胞自噬相關(guān)性最大(r=-0.779,P＜0.01),賴氨酸相關(guān)性最小(r=-0.517,P＜0.01),苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸與細(xì)胞自噬的相關(guān)系數(shù)分別為-0.566,-0.527和 -0.531,均 P＜0.01。其余氨基酸與細(xì)胞自噬無相關(guān)性。

3 討論

細(xì)胞自噬是生物在發(fā)育、老化過程中存在的一個(gè)凈化自身受損蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的機(jī)制,貫穿于正常細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和生理病理過程,對(duì)于維持蛋白質(zhì)代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要的作用,在防止神經(jīng)退行性病變、腫瘤、病原微生物感染等疾病及延長(zhǎng)壽命起積極作用[3],因此對(duì)細(xì)胞自噬作用的研究不僅有理論意義也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

隨著年齡的增加自噬功能下降造成異常蛋白質(zhì)、DNA以及細(xì)胞器進(jìn)行性的積聚,這些積聚的蛋白質(zhì)分子是老化與許多急、慢性疾病的主要病因[2]。在大鼠長(zhǎng)期的刺激自噬可延緩衰老[4]。腫瘤細(xì)胞中自噬能力明顯低于正常細(xì)胞,因其對(duì)血漿氨基酸降低或高細(xì)胞密度等因素反應(yīng)遲鈍[5]。可見對(duì)自噬誘導(dǎo)或抑制的研究具有重要的意義。細(xì)胞自噬信號(hào)的調(diào)控目前研究較多的是 mTOR信號(hào)途徑[2]。TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,是自噬的負(fù)調(diào)控分子[6]。自噬的消長(zhǎng)受多因素的影響[7],饑餓(尤其是氨基酸減少)、胰高血糖素可以誘導(dǎo)自噬;胰島素抑制自噬。他們的作用點(diǎn)在于影響血漿氨基酸的濃度,當(dāng)氨基酸濃度降低時(shí),自噬啟動(dòng);相反自噬被抑制[2,4]。細(xì)胞自噬活性隨年齡增加而下降,這種下降可能與年齡相關(guān)的消化吸收后氨基酸水平的增加和/或基礎(chǔ)水平胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的增加有關(guān)[8]。推斷當(dāng)氨基酸水平升高時(shí)激活 TOR激酶抑制了自噬的發(fā)生,相反則激活自噬[4]。由此可見血漿氨基酸水平和細(xì)胞自噬的程度密切相關(guān),探討從血漿氨基酸水平調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬程度的研究目前國(guó)內(nèi)外較少。

本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同的禁食方式使大鼠定期處于饑餓狀態(tài),經(jīng)過一段時(shí)間干預(yù)后檢測(cè)大鼠血漿中必需氨基酸的濃度,結(jié)果顯示兩干預(yù)組中纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度較對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余必需氨基酸三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值顯示兩干預(yù)組的該比值明顯大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見與正常飲食對(duì)照組相比,兩干預(yù)組中纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度均明顯降低,細(xì)胞自噬程度均明顯增強(qiáng)。但兩種不同的禁食方式對(duì)該結(jié)果的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相關(guān)性分析顯示纈氨酸濃度與細(xì)胞自噬程度的相關(guān)性最大,賴氨酸的相關(guān)性最小,苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)系數(shù)介于二者之間。通過實(shí)驗(yàn)我們可知定期饑餓可降低某些血漿必需氨基酸濃度和增強(qiáng)細(xì)胞發(fā)生自體吞噬的程度,相關(guān)性分析顯示這些必需氨基酸的濃度和細(xì)胞自噬的程度呈負(fù)相關(guān),其中纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度對(duì)細(xì)胞自噬的程度影響較大,實(shí)驗(yàn)采用的兩種不同禁食方式對(duì)血漿氨基酸及細(xì)胞自噬的影響無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們推測(cè)通過調(diào)節(jié)血漿氨基酸的水平來調(diào)控細(xì)胞自噬將是細(xì)胞自噬在臨床應(yīng)用中的一個(gè)方向。低血漿氨基酸水平是否通過抑制 TOR激酶激活了 mTOR信號(hào)途徑進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞發(fā)生自體吞噬及其相應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制和非必需氨基酸對(duì)細(xì)胞自噬的影響等將有待于進(jìn)一步研究。

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