消瘀化痰方對非酒精性脂肪肝大鼠血清 TNF-α和 IL-6含量的影響*

河北省石家莊市第一人民醫院 （石家莊 050011）

羊淑平 馬小寧 韓 芳△ 李 昌△△ 高 瑋△△ 韓 雪△△ 李美錫△△△

消瘀化痰方系經過多年臨床篩選出的治療非酒精性脂肪肝 （NAFLD）的效方,既往藥效學實驗已證實消瘀化痰方具有顯著的調節血脂和抗脂肪肝作用。[1]本研究采用高脂飲食建立 NAFLD模型,觀察大鼠血清腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細胞介素 -6（IL-6）的含量變化,探討消瘀化痰方治療 NAFLD的作用機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性 SD大鼠 50只,體重 180～200 g,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供,合格證號:SCXC（鄂）2004-007。

1.2 藥物及試劑 消瘀化痰方的組成與制備:消瘀化痰飲由澤瀉、丹參、海藻、生黃芪、制半夏、生大黃、郁金、決明子、生山楂、柴胡、炒白術組成,以上藥物先用乙醇提取,揮發去酒精,然后將全部藥渣加水適量,普通方法煎煮,將提取液與煎煮液混合,濃縮成所需濃度。東寶甘泰片:通化東寶藥業股份有限公司出品,批號為H22024764。實驗時用 0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細胞介素 -6（IL-6）試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免所。

1.3 主要儀器 FJ-2020型 γ射線免疫計數器（國營 262廠）,MSE-25型高速冷凍離心機 （上海安亭科學儀器廠）,LAUDA-C3型循環恒溫水浴箱 （泰克儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與造模 50只健康雄性 SD大鼠,飼養于 18℃～22℃明暗各 12 h的清潔級動物實驗室內,正常喂養 1周后,隨機分為 5組,即:正常對照組 （簡稱正常組）、模型對照組 （簡稱模型組）、消瘀化痰方高、低劑量組 （簡稱高、低劑量組）、陽性藥 （東寶肝泰）對照組 （簡稱對照組）。動物造模參照文獻[2]喂飼高脂飼料,高脂飼料由1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和 88%基礎飼料制成。除正常組喂飼普通飼料外,其余各組均給予高脂飼料,連續 9周。

2.2 給藥方法及標本處理 大鼠造模的同時,各組分別給予相應藥物灌胃,給藥劑量按藥理實驗方法學計算,消瘀化痰方高、低劑量組分別按43.34 g/kg、21.67 g/kg體重的標準灌服,對照組按 0.9 g/kg體重的標準灌服,正常組和模型組灌服生理鹽水。各組 1次/d灌胃,每次用藥體積均按 1 mL/100 g計算。實驗 9周末,于最后 1次給藥禁食 12 h后斷頭取血,迅速將血樣低溫離心,分離血清,密封,-20℃冷存待檢。在肝臟最大葉距邊緣 1 cm處取肝組織 0.5 cm×0.5 cm浸泡于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察肝組織形態變化。

2.3 指標檢測

2.3.1 肝組織形態學觀察:取大鼠用 4%的多聚甲醛固定的肝組織,常規石蠟包埋切片,HE染色,光學顯微鏡觀察。

2.3.2 TNF-α和 IL-6的測定:均采用放射免疫法,嚴格按試劑盒說明書檢測。

3 結果

3.1 肝組織形態學改變 光鏡下可見:正常組大鼠肝組織結構完整、清晰,肝小葉結構正常,中央靜脈大而壁薄,肝細胞排列成肝索,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,細胞呈多邊形。模型組大鼠肝細胞中度細胞水腫,少量的肝細胞壞死,多數肝細胞內可見大小不等、數量不一的脂滴空泡 （脂肪變性）,重度變性者,脂滴空泡融合,呈現中至重度脂肪變性,但未見明顯的纖維化改變。各治療組動物肝小葉和肝血竇結構清晰,高、低劑量組肝細胞內脂滴空泡基本消失,對照組中少量的肝細胞內仍有脂滴空泡,并有輕度的細胞水腫。

3.2 消瘀化痰方對 NAFLD大鼠血清 TNF-α和IL-6含量的影響 結果顯示,模型組大鼠的血清TNF-α和 IL-6的含量較正常組明顯升高 （P＜0.01）,經藥物治療后,各用藥組血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型組 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低劑量組大鼠血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于對照組 （P＜0.05）,高、低劑量組之間差異無顯著性 （P＞0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-6測定結果比較 （±s,n=10）

表1 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-6測定結果比較 （±s,n=10）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與對照組比較,△P＜0.05

組別 TNF-α（ng/m L） IL-6（ng/mL）正 常 組 0.73±0.11** 16.7±2.16**模 型 組 1.41±0.18 22.4±3.92高劑量組 0.82±0.13**△ 17.6±2.85**△低劑量組 0.86±0.15**△ 17.2±2.77**△對 照 組 1.16±0.21* 19.4±3.53*

4 討論

課題組人員經多年臨床觀察認為 NAFLD多由飲食失節,恣食肥甘厚味,損傷脾胃,使其運化失常,釀生痰濁,聚集體內,痰阻氣滯,肝失調達,血脈瘀阻,痰瘀結于脅下,形成本病。故痰瘀互結、肝脾失調為其主要病機,消痰化瘀、健脾疏肝為其有效治法。因此,精心篩選相關藥物組成消瘀化痰飲,經臨床應用療效滿意。方中選用澤瀉、制半夏、海藻除水濕、消痰濁;丹參、郁金活血通絡,祛肝經之瘀,增強肝臟血運;生大黃通腑導滯,降濁祛脂,與澤瀉配用,分流疏導,使邪有去路;生山楂祛瘀消積;柴胡、決明子疏肝利膽,清肝經郁熱;生黃芪、炒白術補氣健脾,以助痰瘀的運除,而且也體現了 “見肝之病,當先實脾”的治療法則。諸藥合用則清降痰濁瘀積,調節肝脾功能,從而達到抗脂肪肝的目的。

高脂飲食所誘發的血漿低密度脂蛋白、甘油三酯和游離脂肪酸含量增高,以及伴隨的高密度脂蛋白水平下降和腸源性內毒素血癥,使肝臟枯否氏細胞聚集、增生和激活,枯否氏細胞可分泌 TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子,導致生物膜的損傷。研究表明,肝臟枯否氏細胞過量分泌 TNF-α、IL-6等因子是引起肝細胞壞死的重要介質。[2-4]TNF通過與細胞表面的 TNF受體結合而起作用,肝細胞的 TNF受體具有高親和力、低容量等特點,故對低濃度的 TNF-α即可發生強烈反應,另外,TNF-α是脂蛋白酶的強力抑制劑,高濃度的 TNF-α可減少外周組織脂肪分解,并促進肝細胞甘油三酯的合成及聚集。TNF-α還可誘導IL-1、IL-6等細胞因子的產生,共同參與肝損害,另外還可引起中性粒細胞趨化,進而導致肝臟炎癥反應,并通過脂質過氧化使細胞受損,最終導致肝細胞壞死。[5]

本項研究結果顯示,采用高脂飲食復制的NAFLD動物模型大鼠,由于實驗過程中長期大量進食高脂肪、高膽固醇飲食,游離脂肪酸 （FFA）被肝臟攝取量也隨之增多而蓄積,FFA是具有高度細胞毒性的兩性分子,FFA作用于肝細胞,可導致肝細胞線粒體腫脹和通透性增加、肝細胞變性、壞死和炎癥細胞浸潤,誘發非酒精性脂肪性肝炎,內毒素血癥可激活肝細胞或/和枯否細胞,促使其分泌 TNF-α、IL-6等細胞因子,導致生物膜的損傷。經藥物干預后,治療各組血 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型組 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低劑量組低于陽性藥對照組 （P＜0.05）;而高、低劑量組之間和 TNF-α和 IL-6的含量未見明顯差異 （P＞0.05）,說明各用藥組均有抑制枯否細胞過度活化、降低血清 TNF-α和 IL-6的含量,減少炎性細胞浸潤的作用,而消瘀化痰方的保護肝臟作用優于陽性對照藥。

綜上所述,經動物實驗證實,TNF-α和 IL-6在NAFLD的發生、發展中起著重要作用,TNF-α和 IL-6合成與釋放過多介導了肝損傷的發病過程。因此,檢測血清中血清 TNF-α和 IL-6的含量高低可以作為 NAFLD臨床診斷的重要參考指標之一。另外,消瘀化痰方可顯著降低血清血清 TNF-α和 IL-6含量,防止其對肝臟的進一步損害,此可作為消瘀化痰方治療NAFLD的作用機制之一。

[1] 苗卉,魏翠萍,張一盺,等.消瘀化痰飲對非酒精性脂肪肝大鼠脂質代謝和肝組織形態學的影響 [J].河北中醫藥報,2007,22（2）:3-5

[2] 陳賢明,馬學惠,許瑞齡,等.酒精刺激對枯否氏細胞清除LPS功能的影響 [J].中國病理生理雜志,1998,14（4）:389

[3] 任紅,張定風,賈小平,等.病毒性肝炎腫瘤壞死因子和白細胞介素 6的研究 [J].中華醫學雜志,1989,5（3）:264

[4]McClain CJ,Barve S,Dohn L,et al.Cytokines in alcoholic liver disease[J].Semin Liver Dis,1999,19:205

[5] 范建高,曾民德.脂肪肝 [M].上海:上海醫科大學出版社,2000.69

（2009-12-30 收稿）