肝性腦病中肝腦組織硝基化損傷的研究進展

葉 青，邵麗華

(1山東大學醫學院，濟南250012;2山東大學公共衛生學院)

肝性腦病(HE)是肝炎、肝硬化的嚴重并發癥。有資料顯示，HE病死率為78% ～84%。目前HE發病機制尚未完全闡明。現將近年來關于HE發病與肝臟和腦組織中硝基化損傷關系的研究進展綜述如下。

1 機體內組織細胞硝基化損傷的機制

機體在病理狀態下，如缺血、缺氧或炎癥時，體內自由基包括過氧化亞硝酸陰離子(ONOO-)、過氧化氫、羥自由基等大量增加，使體內氧化能力超過抗氧化能力從而引起氧化應激，幾乎同時引起硝化應激，使生物膜脂質過氧化、蛋白質硝基化及酶變性、DNA損害，最后導致細胞損傷和疾病的發生［1］。活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)是引起氧化應激和硝化應激的主要原因。氧化應激伴隨著硝化應激。RNS/ROS水平的升高將導致ONOO-增加，ONOO-是一種強硝化劑，性質很活潑，能夠迅速與周圍物質發生硝基化反應;其可使蛋白質中酪氨酸殘基硝基化，此為ONOO-對蛋白質的特征性損傷。蛋白質的硝基化可導致蛋白質結構改變，從而影響到蛋白質的生物化學功能，使細胞內許多重要的酶類失活［2］。

蛋白質酪氨酸殘基被ONOO-硝基化生成的3-硝基酪氨酸已被多數學者視為機體內 ONOO-的“分子指紋”［3］。ONOO-在體內半衰期非常短暫，僅100 ms;而蛋白質硝基化產物一旦形成則不容易消失，通過檢測3-硝基酪氨酸可判斷體內硝基化損傷的情況。蛋白質硝基化是一種“蛋白質翻譯后修飾”，修飾后功能的變化已引起人們關注。蛋白質中的酪氨酸殘基被硝基化后，蛋白質結構發生變化，可生成新的抗原不被機體免疫系統所認識，從而造成自身免疫問題;酶屬于蛋白質，酶的硝基化會引起與該酶相關的生物學活性的改變，繼而引起機體一系列生理生化機能的紊亂;細胞內蛋白質酪氨酸硝基化可阻礙酪氨酸磷酸化，導致細胞信號傳導障礙等［3］。動物模型研究顯示，在氧化或硝化應激過程中，細胞線粒體內有些重要的蛋白質酶類，尤其是在肝臟細胞內，如Mn-SOD、細胞色素C、電壓依賴的陰離子通道、ATP酶和琥珀酰CoA等發生酪氨酸硝基化，導致呼吸鏈傳遞障礙，使線粒體的ATP合成減少，細胞內能量耗竭，出現細胞凋亡和壞死。

2 蛋白質硝基化損傷在肝性腦病發生發展中的作用

2.1 導致細胞生理或生化功能異常 蛋白質硝基化導致的線粒體破壞和細胞膜氧化等可對肝、腦細胞造成損傷。研究表明，蛋白質硝基化可造成實驗性肝細胞損傷和腦神經元損傷，導致肝細胞DNA損傷、細胞凋亡等［4］。有研究報道，硝基化可損傷大鼠腦神經元，神經元內蛋白質酪氨酸硝基化產物明顯增多。硝基化誘導腦細胞凋亡也已被證實［5］。氧化/硝基化可破壞細胞膜的完整性，導致神經細胞的靜息膜電位改變、神經傳導速度減慢和神經絲的降解或丟失［6］。

2.2 肝臟氧化還原平衡失調與蛋白質硝基化 HE患者血液中內毒素、腫瘤壞死因子較正常人升高，這兩者均是一氧化氮合酶(NOS)的促進劑［7］。NOS被激活，促進NO的合成，使體內 NO 大量增加［8］，并伴隨著病情加重而增加［9］。此外HE患者抗氧化防御能力降低，體內超氧離子O-2·升高，而NO與O-2·會迅速反應生成ONOO-，該反應幾乎不可逆。

肝臟是機體主要的能量供應站，含有豐富的線粒體。線粒體是ONOO-生成和反應的主要場所。NO擴散通過細胞膜時與線粒體產生的O-2·反應生成ONOO-。肝臟受損時SOD活性下降，O-2·增加，可形成促進催化生產ONOO-的系統，增加ONOO-的生成。ONOO-的大量增加促使組織細胞的硝基化損傷。肝細胞內的線粒體呼吸配合物含有大量的鐵—硫蛋白質，在氧化/硝基化應激條件下，肝臟細胞內ONOO-的細胞毒性導致鐵硫基團和蛋白質中酪氨酸殘基的硝基化［10］，引起線粒體三磷酸腺苷合成障礙，機體能量缺乏。通常情況下，肝臟有充分的氧化還原平衡能力，能夠平衡由于缺血、缺氧或炎癥時體內自由基，保護組織細胞正常的生物學活性。但當肝臟受損時，氧化/硝化應激性損傷大大增加，超過了肝臟的抗氧化能力從而引起彌漫性的氧化/硝化應激，促使蛋白質硝基化損傷，最后導致細胞損傷和生物學功能異常。

2.3 氨與硝基化 HE神經病理學性特點是星形膠質細胞腫脹、小膠質細胞活化與阿爾茨海默II型星形膠質細胞的增生。分子生物學研究顯示，肝性腦病患者大腦星形膠質細胞中關鍵蛋白質基因表達異常，包括神經膠質酸性蛋白(GFAP)和谷氨酸轉運蛋白(EEAT-2)早期表達減少，同時伴隨星形細胞/小膠質細胞線粒體苯二氮艸卓受體(MBR)的增加。EAAT-2表達減少引起谷氨酸運轉受阻，星形膠質細胞和神經元之間的谷氨酸—谷氨酰胺循環障礙，細胞外谷氨酸增加，繼而N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的環鳥苷酸NO的信號轉導通路被激活，星形膠質細胞的關鍵蛋白質如谷氨酰胺合成酶(GS)和線粒體苯二氮艸卓受體的酪氨酸殘基硝基化，導致腦氨增多和腦神經反應抑制。GS專門負責為大腦清除多余的氨。氨誘導的星形膠質細胞或小膠質細胞線粒體苯二氮艸卓受體的活化導致γ-氨基丁酸-A(GABAA)神經調節受體蛋白質分子變構，促使神經類固醇的合成。研究發現，氨在HE中起關鍵作用，隨著急性和慢性肝臟衰竭表現出神經精神癥狀。在腦組織中氨可引起星形膠質細胞腫脹，繼而觸發NADPH氧化酶、NOS、線粒體的氧化/硝化應激等，導致酪氨酸殘基硝基化使蛋白質結構改變、腦星形膠質細胞和神經元細胞RNA的氧化、細胞間信號傳導和突觸的可塑性降低。氨誘導的RNA氧化和蛋白質的硝基化作用會損害突觸后蛋白合成，嚴重影響大腦學習和記憶的定式。RNA的氧化對HE的多重神經遞質系統紊亂和基因表達紊亂以及認知障礙提供了一種新的解釋［11］。急性肝衰竭時腦水腫(引起顱內壓增高甚至腦疝)是急性肝衰竭的主要死因，而星形膠質細胞腫脹是顱內壓升高的主要因素。實驗表明氨通過增加NKCC細胞的活性可導致體外培養的星形膠質細胞腫脹，用藥物抑制NKCC活性則星形膠質細胞腫脹消失。當培養的星形膠質細胞暴露于氨，可引起NKCC的硝基化，使其活性增加，證實NKCC的硝基化在膠質細胞腫脹中起關鍵性作用［12］。

綜上所述，肝臟和腦組織細胞的蛋白質硝基化對HE的病理生理過程有重要影響。深入研究蛋白質硝基化在HE的發生、發展中的作用，有助于進一步闡明HE的病因和發病機制，并為其治療提供新的思路。

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