MMP-9抑制劑巴馬司他對體外循環(huán)犬肺組織中 iNOS表達(dá)的影響

馮俊波,葛圣林*,龔文輝,張成鑫

(1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥 230022；2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

體外循環(huán)(CPB)過程中,缺血再灌注(IR)可致急性肺損傷。實驗表明,IR時肺組織中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)活性增強(qiáng)[1],導(dǎo)致生成大量的 NO,與超氧陰離子結(jié)合后,使過氧化亞硝酸堆積,加重肺組織損傷。基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP-9)能降解肺毛細(xì)血管基底膜中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分,使肺毛細(xì)血管通透性增加和炎性細(xì)胞進(jìn)一步浸潤[2]。2008年 3月 ～2009年 3月,我們觀察了外源性 MMP-9抑制劑巴馬司他對犬體外循環(huán)肺組織中 iNOS表達(dá)的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 16只出生半年左右的健康雜種幼犬(體質(zhì)量 10～12 kg),MMP-9 ELISA試劑盒,巴馬司他,戊巴比妥鈉,iNOS試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與 CPB模型的建立 將幼犬隨機(jī)分為對照組和實驗組,各 8例。兩組均建立 CPB模型:戊巴比妥鈉 30 mg/kg靜注,22 G留置針插犬右下肢動脈測動脈血壓及備取血樣用,22 G留置針插犬左下肢靜脈備輸液及備取血樣用；行氣管插管,機(jī)械通氣,輔助呼吸。FiO2100%,潮氣量 15 ml/kg,頻率 15～18次/min。前正中切口,靜脈給予肝素 600 U/kg,檢測激活凝血時間(ACT)＞480 s。升主動脈插管(4 mm),上下腔插管(36 Fr),經(jīng)肺動脈插入10F動脈灌注管,左房放置 18F靜脈引流管。心肌保護(hù)采用改良 St.Thomas液 10 ml/kg,每 30 min灌注 1次。降溫,泵流量 50～80 ml/(kg? min)轉(zhuǎn)流,建立 CPB模型。CPB 60 min后開放主動脈,心臟復(fù)跳,恢復(fù)肺動脈血供,維持循環(huán)穩(wěn)定,并持續(xù)呼吸機(jī)輔助通氣,90 min撤離 CPB。于術(shù)后 3 h 10%KCl處死實驗犬。

1.2.2 巴馬司他應(yīng)用方法 實驗組在升主動脈阻斷后,用含巴馬司他 30 mg/kg的肺保護(hù)液(654-2、NaHCO3等,滲透壓為 350 Osm)持續(xù)灌注肺動脈,流量為 30 ml/(kg?min),開放升主動脈后停止灌注。對照組灌注不含巴馬司他的肺動脈保護(hù)液,方法同實驗組。

1.2.3 犬肺組織病理觀察 CPB結(jié)束后,取左上肺標(biāo)本,用 4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。同時,另取左上肺標(biāo)本,用戊二醛迅速固定,切割成1 mm3大小的 6塊。戊二醛固定、漂洗、鋨酸固定、包埋、聚合、切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,用Jeol JEM-1230透射電鏡觀察形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 犬肺組織中 iNOS檢測方法 取肺組織塊 1 g,放入預(yù)冷的緩沖液 9 ml中,用勻漿器制成 10%的肺組織勻漿。取肺組織勻漿 4℃ 3 000 r/min離心15 min,取上清液,按 iNOS試劑盒說明書應(yīng)用酶譜儀測量標(biāo)準(zhǔn)物及各個樣品的光密度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式。將樣品的 OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即測量出各樣品中 iNOS水平。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件。應(yīng)用 Levene檢驗對各組數(shù)據(jù)間進(jìn)行方差齊性檢驗,兩組間比較應(yīng)用 LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組犬肺組織病理變化 光鏡下,實驗組肺泡結(jié)構(gòu)較完整,肺泡腔清晰,炎癥改變相對較輕,水腫及出血減少；對照組肺泡壁彌漫性滲出水腫,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,肺泡壁和肺間質(zhì)內(nèi)可見大量白細(xì)胞浸潤以及肺泡結(jié)構(gòu)破壞。電鏡下,對照組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞基底膜變薄,細(xì)胞游離面微絨毛消失,線粒體腫脹破裂,嵴紊亂消失,多數(shù)板層小體排空,形成較大空泡；實驗組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)較對照組明顯好轉(zhuǎn),細(xì)胞游離面微絨毛有序排列,線粒體輕度腫脹,嵴排列稍紊亂,板層小體空泡化較對照組明顯減輕。

2.2 兩組犬肺組織中 iNOS水平比較 實驗組犬肺組織中 iNOS為(1.69±0.32)U/mg prot,明顯低于對照組的(2.25±0.43)U/mg prot,P＜0.05。

3 討論

CPB后肺損傷發(fā)生的具體機(jī)制尚未完全清楚,但中性粒細(xì)胞釋放的血漿蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)已被認(rèn)為與 CPB引起的急性肺損傷和ARDS密切相關(guān)[3]。MMP-9是 MMPs家族中一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶,參與 ECM的降解和重建,并可作為中性粒細(xì)胞的趨化因子,引起中性粒細(xì)胞聚集。MMP-9可降解由Ⅳ型膠原等組成毛細(xì)血管和肺泡上皮的基膜,導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增加,使富含蛋白的血漿進(jìn)入肺泡,發(fā)生肺水腫、肺內(nèi)分流增加、低氧血癥等,最終導(dǎo)致急性肺損傷甚至 ARDS。近年來,越來越多研究證實 MMP-9在 CPB后循環(huán)中明顯增加[4],且與急性肺損傷明顯相關(guān)。金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是一種內(nèi)源性 MMPs抑制劑,可以抑制所有的 MMPs。TIMPs與 MMPs之間的平衡是 ECM維持完整的前提條件。在急性肺損傷過程中存在 TIMPs和 MMPs的失衡,應(yīng)用 TIMPs可減輕肺損傷程度。巴馬司他是 MMPs的外源性特異性抑制劑,其首先作為抗腫瘤尤其是抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物被開發(fā)應(yīng)用的,且動物的急性和長期毒性實驗表明無明顯毒性。鑒于 MMP-9在 CPB急性肺損傷發(fā)病中的重要作用,我們認(rèn)為 MMPs抑制劑可能在CPB急性肺損傷的治療中發(fā)揮重要作用。

一氧化氮合酶(NOS)的主要功能是催化 L-精氨酸生成 NO。NO作為一種重要的信使分子,具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞的作用。NO能舒張平滑肌(選擇性擴(kuò)張肺血管,調(diào)節(jié)氣道平滑肌的張力),抑制炎癥介質(zhì)釋放(抑制白細(xì)胞黏附及趨化,抑制血小板黏附及聚集等),從而降低肺血管阻力(PVR),減少肺內(nèi)分流,改善供肺的氧合,但大量NO對機(jī)體有氧化損傷和致炎癥作用。目前發(fā)現(xiàn)并定名的人體內(nèi)NOS有3種,Ⅰ型主要存在腦和神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),稱為腦型(bNOS)或神經(jīng)型(nNOS)；Ⅲ型主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上,稱為內(nèi)皮型(eNOS)；Ⅰ型和Ⅲ型又統(tǒng)稱構(gòu)成型(cNOS),是許多正常組織中正常存在的一種酶。其合成的 NO在維持神經(jīng)細(xì)胞的效應(yīng)傳遞功能和血管的舒縮功能等方面有重要作用。Ⅱ型稱為 iNOS,存在于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中,只在細(xì)胞受到刺激被激活后才表達(dá)。其生成 NO的量比 cNOS高出上千倍,能持續(xù)產(chǎn)生 NO數(shù)日[5]。

研究發(fā)現(xiàn),iNOS與 IR損傷密切相關(guān)。文獻(xiàn)報道,離體肺 IR損傷后,eNOSmRNA表達(dá)降低,而 iNOSmRNA表達(dá)增高[6]。有實驗表明,肺損傷時肺組織中的 NO主要來源于 iNOS,而 eNOS的作用很小[7]。iNOS的生成增加可產(chǎn)生大量的NO,NO能破壞細(xì)胞代謝、損傷 DNA引起細(xì)胞死亡；并能直接損傷組織,促進(jìn)吞噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF),繼而增加細(xì)胞因子介導(dǎo)的組織損傷。大量生成的 NO可與氧自由基結(jié)合,生成毒性更強(qiáng)的過氧亞硝酸離子。有文獻(xiàn)報道,iNOS本身也具有氧自由基生成活性,能誘導(dǎo) O-2的生成[8]。曹華等[9]實驗證實,再灌注肺組織中 eNOS表達(dá)下調(diào),iNOS在肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的表達(dá)明顯增強(qiáng)。胡靜等[10]研究表明,應(yīng)用 iNOS抑制劑氨基胍,能明顯減輕博萊霉素引起的肺損傷。

我們采用外源性 MMP-9抑制劑巴馬司他進(jìn)行犬 CPB模型的肺動脈灌注,常規(guī)病理及電鏡顯示實驗組肺損傷程度較對照組明顯減輕,實驗組肺組織iNOS表達(dá)量低于對照組,提示應(yīng)用巴馬司他進(jìn)行肺動脈灌注,能減輕 CPB中的肺損傷,減少肺組織中iNOS的產(chǎn)生。其原因可能是缺血狀態(tài)下 eNOS表達(dá)下調(diào),NO合成減少,加劇了血小板聚集,白細(xì)胞黏附,產(chǎn)生大量 TNF、IL-21、IL-28等細(xì)胞因子和內(nèi)毒素,誘導(dǎo)肺內(nèi) iNOS表達(dá)增強(qiáng)[11]。而巴馬司他能抑制 MMP-9引起中性粒細(xì)胞聚集,減少了 TNF、IL-21、IL-28等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而減少了肺組織內(nèi)iNOS的生成。

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