卵巢癌細胞卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因的表達變化及其啟動子區甲基化觀察

唐兆前,李 力,張 瑋,王 琪,唐步堅

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,南寧 530021)

卵巢癌化療藥物耐藥現象成為影響其療效的主要原因。研究發現,在惡性腫瘤中表觀遺傳基因對于調控原發性以及獲得性耐藥都起重要作用[1],其中 DNA甲基化是基因突變及缺失之外腫瘤抑制基因失活的第三種機制。2008年 7月 ～2010年 2月,我們觀察了卵巢癌卡鉑耐藥細胞系(SKOV3-CB)中各抑癌基因啟動子區的甲基化狀態,以探討其與卵巢癌卡鉑耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑 Trizol,逆轉錄試劑盒RevertAid Fiststrand cDNA Synthesis Kit,DNAzol基因組 DNA快速提取試劑盒,Cp Genome DNA修飾試劑盒,凝膠成像系統 quality-one,實時熒光定量 PCR儀,卵巢癌卡鉑耐藥細胞系 SKOV3-CB、親本細胞系SKOV3及其表達譜芯片。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因的篩選

應用分子生物信息學方法,在“www.ncbi.nlm.nih.gov”網站,查找 “tumor suppressor gene”,篩選卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因,共 13個腫瘤抑制基因(VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8)表達下調。

1.2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因表達的檢測 待 SKOV3-CB、SKOV3細胞長滿瓶底的70%～80%時,獲取細胞 1×107～5×107個,移入1.5 ml離心管中。根據 Trizol法提取細胞總 RNA并行凝膠電泳,用紫外分光光度儀檢測抽提總 RNA的質量和濃度。要求 A260/A280為 1.8～2.0,并計算RNA含量。cDNA合成參照逆轉錄試劑盒說明書操作。RT-PCR反應:應用引物設計軟件 Primer 5.0設計引物,并由上海生工生物技術有限公司合成。在DNA Engine Opticon TM連續熒光檢測系統中進行擴增。陰性對照以無 RNA酶的水代替 cDNA模板。每例樣品及對照均設 3個平行復孔,取平均值。反應結束后,由軟件自動得出熒光反應曲線以及每個標本反應體系的擴增效率及 CT值。SKOV3-CB相對于 SKOV3表達的計算公式:XN,q/XN,cb=

1.2.3 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因啟動子區甲基化狀態檢測 登陸“http://genome.ucsc.edu/”查找出各基因的啟動子,應用 Methyl Primer Express Software Version 1.0軟件,對所篩選基因進行 CpG島評估,設計出 8個基因(VHL,COPS2、NOL7、RBL1、PARG1、PERP、DNAJA3)的引物,由上海生工生物技術有限公司合成。采用甲基化特異性 PCR(MS-PCR)法檢測 SKOV3-CB、SKOV3細胞 8個基因啟動子區甲基化狀態,操作按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因表達情況 與 SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因表達比較,除 GGNBP2基因外,其余 12個基因 VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8 均在 SKOV3-CB中表達下調,下調倍數分別為 65.24、1.30、2.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.00、23.98。

2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因啟動子區甲基化狀態 MS-PCR結果顯示,ING1、NAJA3、VHL甲基化引物均能夠擴增出產物,未甲基化引物均不能擴增出產物；COPS2、PERP甲基化引物均不能夠擴增出產物,未甲基化引物均能夠擴增出產物；PARG1,、NOL7、RBL1甲基化引物與未甲基化引物均能夠擴增出產物。

3 討論

基因甲基化是一種可遺傳的、酶誘導的、對基因結構的特殊堿基序列起穩定作用、負責編碼正常基因的化學修飾。即在甲基轉移酶(DNMTS)作用下將一個甲基集團加到 DNA分子核苷酸堿基上的生化過程[3]。人類 DNA甲基化 90%發在 CpG二核苷酸,基因組中 Cp G密集的區域稱作 CpG島,多分布于 5′和 3′非編碼區。盡管全基因組中 CpG島甲基化是高發的,但在活化基因的 5′非編碼區啟動子區內,CpG島都呈去甲基化狀態[4]。如果啟動子區CpG島發生甲基化,將直接或間抑制轉錄,導致下游基因表達沉默。因此,啟動子區 CpG島甲基化是抑制基因表達的重要機制。

腫瘤抑制基因啟動子區 CpG島頻繁發生異常的甲基化,導致基因沉默或表達下調[5]可能是卵巢癌患者化療耐藥的重要原因[6]。其甲基化狀態可作為反映藥物療效和抗藥性的一個有用的指標[7]。因而,探討其可能的甲基化機制,對卵巢癌卡鉑耐藥的研究有重要意義。即便沒有甲基化機制參與,也可為進一步探討其他的可能機制提供參考。我們通過卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因的檢測,發現13個基因中 ,VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、 ING1、 RARRES3、RBBP8共 12個基因表達下調。這表明多腫瘤抑制基因參與卵巢癌卡鉑耐藥。通過對下調基因啟動子區 CpG島評估,發現有 8個基因 (ING1、PERP、RBL1、COPS2、VHL、PARG1、 NOL7、DANJA3)能夠設計出甲基化引物進行 MSP。MSP結果顯示,在卵巢癌卡鉑耐藥細胞系與其親本細胞系中,ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能夠擴增出產物,未甲基化引物均不能擴增出產物；COPS2、PERP甲基化引物均不能夠擴增出產物,未甲基化引物均能夠擴增出產物；在兩種細胞系中 PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物與未甲基化引物均能夠擴增出產物。換言之,本研究沒有發現以上兩種細胞系各相關腫瘤抑制基因啟動子區有差異甲基化。因此,卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因啟動子區無超甲基化,甲基化機制不是引起卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因表達下調的原因。

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