MMP-2靶向 RNAi質粒的構建及其對小鼠巨噬細胞 MMP-2表達的沉默作用

王 政,李為民,周宏艷,郭虹鳳,孫文學

(哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院,哈爾濱 150001)

RNA干擾(RNAi)是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制,是指內源性或外源性與靶基因的轉錄產物 mRNA存在同源互補序列的雙鏈 RNA(dsRNA),在細胞內特異地降解該mRNA,是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(PTGS)[1]。 RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強等優點[2]。肺間質纖維化是一種進行性加重的彌漫性肺疾病,可造成肺結構與功能不可逆損傷[3]。近年發現,基質金屬蛋白酶(MMPs)在肺纖維化的發生發展中起重要作用[4]。2009年 9～11月,我們設計了能轉錄小發卡結構 RNA(shRNA)的DNA序列,并與 psiSTRIKETM質粒載體連接,構建受控于人 RNA聚合酶Ⅲ啟動子 U6的真核表達載體,以脂質體法將重組質粒導入小鼠巨噬細胞內,觀察該質粒對小鼠巨噬細胞 MMP-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 psiSTRIKETMU6載體,小鼠巨噬細胞系RAW264.7,限制性內切酶 Pst I,質粒小量提取試劑盒,凝膠回收試劑盒,LipofectamneTM2000轉染試劑,總 RNA提取試劑盒,cDNA反轉錄試劑盒,RPMI-1640培養基,山羊抗鼠 MMP-2抗體,FITC-兔抗山羊IgG。

1.2 方法

1.2.1 MMP-2特異性 siRNA的設計 從 GenBank中選取小鼠MMP-2基因序列,采用 siRNA Target Designer-Version 1.51設計軟件設計 2對 MMP-2基因發卡寡核苷酸,序列符合 siRNA表達載體 psiSTRIKETMU6的要求。DNA序列片斷由上海生工公司合成。

1.2.2 MMP-2 siRNA表達載體的構建 1μg/μl人工合成單鏈核苷酸在退火緩沖液中,90℃ 3 min后緩慢降到室溫。與 5μl快速連接緩沖液、1μl psiSTRIKETM載體(50 ng/μl)、2 μl Nuclease-Free水和 1μl T4 DNA連接酶(3 U/μl)配制成連接反應液,室溫培養 1 h。加入 100μl E.coli JM109感受態細胞中,冰浴。加入 400μl室溫的 LB培養液,37℃振蕩培養(50 r/min)45 min。200μl轉化液涂在LB/氨芐西林平板上鋪板,37℃過夜培養。挑取菌落,小量提取質粒,經 pst I酶切鑒定正確的重組質粒命名為 psiSTRIKETM-MMP-2,-20℃保存。

1.2.3 psiSTRIKETM-MMP-2基因轉染 將RAW264.7細胞接種于 6孔板,置于 37℃、5%CO2培養箱中,待細胞生長融合達 90%時,采用 LipofectamneTM2000轉染試劑進行轉染。實驗分為實驗組、陰性對照組和空白對照組。實驗組每孔分別加入 4 μl脂質體和 psiSTRIKETM/MMP-2重組質粒 2μg,陰性對照組加 LipofectamneTM2000轉染試劑和 siSTRIKETMU6質粒 2μg,空白對照組則不加任何干擾因素。分別于轉染前、轉染后 24、48、72 h收獲細胞檢測 MMP-2的表達水平。

1.2.4 RAW264.7細胞 MMP-2 mRNA檢測方法采用 RT-PCR法。應用 Trizol試劑盒提取細胞總RNA,用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成 cDNA。以β-actin為內對照,RT-PCR擴增 MMP-2目的基因。產物經含 0.5 mg/L溴化乙啶的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結果,重復 3次。凝膠掃描系統分析處理,以 MMP-2 mRNA與 β-actin mRNA的灰度比值作為MMP-2 mRNA的表達量。

1.2.5 RAW264.7細胞 MMP-2蛋白檢測方法 采用 Western blot法,按試劑盒說明書操作,重復 3次,以凝膠掃描系統 Labworks軟件計算灰度值。

1.2.6 統計學方法 采用 SPSS13.0軟件分析。組內比較和組間比較用方差分析及 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 psiSTRIKETM-MMP-2重組質粒的鑒定結果psiSTRIKETM載體包含一個 PstⅠ位點,重組質粒將會形成第 2個 PstⅠ位點。經限制性 PstⅠ內切酶消化后,成功的重組質粒將產生 2個 DNA片斷。重組質粒 psiSTRIKETM-MMP-2用限制性 PstⅠ內切酶酶切后,瓊脂糖凝膠電泳中可清楚地看到重組載體被切為 2個片斷,證明重組質粒構建成功。

2.2 各組細胞 MMP-2 mRNA表達比較 陰性對照組 MMP-2 mRNA表達量為 1.326±0.052,空白對照組為 1.257±0.067,實驗組轉染 24、48、72 h時分別為 0.713±0.075、0.334±0.059、0.192±0.041,與陰性對照組、空白對照組比較,P均 ＜0.01。

2.3 各組細胞 MMP-2蛋白表達比較 陰性對照組MMP-2蛋白表達量為 185.90±22.72,空白對照組為 182.90±22.72,實驗組轉染 24、48、72 h時分別為 142.66±18.24、53.04±9.86、39.41±5.63,與陰性對照組、空白對照組比較,P均 ＜0.01。

3 討論

肺纖維化是多種原因引起的以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質(ECM)聚集為特征的疾病。其病理特點是長期慢性肺部炎癥及肺泡持續性損傷,反復破壞、修復、重構和膠原過度沉積,肺實質廣泛重塑。肺纖維化的發生是一個復雜的過程,過去認為肺纖維化都是肺部炎癥損傷的結局。現研究發現,其發病機制涉及多種生長因子,包括 MMPs、轉化生長因子-β、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子、成纖維生長因子、血管內皮生長因子等。其中,MMPs尤其是 MMP-2起關鍵作用[5]。MMPs是一類對細胞外基質具有降解活性的蛋白酶超家族。其在中性 pH條件下,依賴 Ca2+和 Zn2+為輔助因子而激活,可以降解所有 ECM成分。近年發現,肺泡上皮細胞破壞與基底膜損傷是肺間質性纖維化病變早期的特點。MMPs與細胞因子、生長因子之間以一個十分復雜的網絡聯系,參與肺間質纖維化的發生發展。肺泡巨噬細胞分泌 MMPs,主要包括 MMP-2、MMP-9等。它們都以酶原的形式被分泌,通過一系列的酶切作用被激活,都可以降解Ⅳ型膠原。其中,MMP-2與細胞因子、生長因子之間的相互激活,通過對 ECM的降解,鏈接了炎癥細胞與肺結構細胞之間的信息交流,介導了肺泡炎癥與進行性肺間質纖維化的進程[6,7]。RNAi是用由 dsRNA前體剪切產生的短的反義 RNA靶定對應的 mRNA,然后進行剪切,促使 mRNA降解。RNAi可以高效、特異的阻斷體內特定基因的表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型,是基因沉默的理想工具,可直接抑制疾病相關基因,從而達到治療或預防疾病的目的[3,4]。

本研究成功克隆了靶向小鼠巨噬細胞 MMP-2的重組質粒。體外實驗表明,psiSTRIKETM-MMP-2重組質粒能明顯下調小鼠巨噬細胞 MMP-2 mRNA和蛋白的表達,且 MMP-2 mRNA和蛋白表達的抑制率相對一致,說明 MMP-2表達的抑制位點在蛋白質翻譯過程之前,這也符合 RNAi轉錄后基因沉默的作用機制。本研究結果說明,psiSTRIKETM-MMP-2 RNA干擾質粒能夠特異、高效地抑制巨噬細胞 MMP-2的表達,提示通過 RNAi降低巨噬細胞中MMP-2表達,可能減少肺臟細胞外基質的降解,從而防止肺纖維化的進展。但肺纖維化是一個長期而又復雜的過程,其中有很多機制我們尚未完全了解,還需要進一步研究。

[1]Mello CC,Conte DJr.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004,431(5):338-342.

[2]Gregory JH,John JR.Unlocking the potential of the human genome with RNA interference[J].Nature,2004,431(2):371-378.

[3]Mert H,Yoruk I,Ertekin A,et al.Vitamin levels in lung tissueof rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis[J].J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo),2009,55(7):186-190.

[4]García-Alvarez J,Ramirez R,Sampieri CL,et al.Membrane type-matrixmetalloproteinases in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis,2006,23(1):13-21.

[5]Radisky DC,Przybylo JA.Matrix metalloproteinase-induced fibrosis and malignancy in breast and lung[J].Proc Am Thorac Soc,2008,5(3):316-322.

[6]Kim JY,Choeng HC,Ahn C,et al.Early and late changes of MMP-2 and MMP-9 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Yonsei Med J,2009,50(11):68-77.

[7]Scabilloni JF,Wang L,Antonini JM,et al.Matrix metalloproteinase induction in fibrosis and fibrotic nodule formation due to silica inhalation[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(4):709-717.

[8]Tafer H,Ameres SL,Obernosterer G,et al.The impact of target site accessibility on the design of effective siRNAs[J].Nat Biotechnol,2008,26(5):578-583.