表觀遺傳學與結直腸癌的關系研究進展

李 臣綜述 陳明清 董 堅審校

表觀遺傳學(Epigenetics)與遺傳學(Genetics)是相對應的概念。遺傳學改變是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化,如基因突變、基因雜合丟失和微衛星不穩定等;而表觀遺傳學改變則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化,如DNA甲基化、組蛋白修飾和基因組印跡等。研究表明遺傳和表觀遺傳異常都參與腫瘤的發生。

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大約有 120萬新發病例,同時至少60萬患者死亡[1]。結直腸癌有著極為復雜的發生發展機制,傳統觀點認為腫瘤的主要機制是由于致癌因素造成 DNA序列變異而導致細胞生長、分化失控。近年來,隨著研究的深入,發現DNA序列以外的調控機制異常在腫瘤的發生、發展過程中更為普遍[2],這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調控機制即為表觀遺傳學機制,這也為結直腸癌的診斷和治療開辟了新的途徑。

1 表觀遺傳學分子機制與結直腸癌

1.1 DNA甲基化與結直腸癌

DNA甲基化是指由 DNA甲基轉移酶(DN-MT)催化,把 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到胞嘧啶 5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)引起基因表達異常的過程。DNA甲基化包括整體基因組的低甲基化和啟動子特殊區域 CpG島的高甲基化。在散發性直結腸癌中,這兩種表觀遺傳學變化在基因不穩定性產生過程中起著重要作用。

1.1.1 整體基因組低甲基化與結直腸癌 研究表明:腫瘤細胞中 DNA甲基化水平只為相應正常細胞的 1/3～1/4,從而導致重復序列的轉錄/轉座活化和基因組的高度不穩定性。結直腸癌組織中 5-mC含量與正常組織相比亦有明顯的下降。低甲基化可引起癌基因如 MDR 1、Ras、c-myc、NT活化,參與腫瘤的發生。在散發性結直腸癌中,這種低甲基化還與染色體不穩定性(chromosomal instability,CIN)和微衛星不穩定性(microsatellite instability,MSI)有關。Matsuzaki等[3]的研究顯示整體基因組低甲基化可引起 CIN,該研究還發現微衛星穩定性(MSS)結腸癌中雜合性丟失(loss of heterozygosity,LOH)出現頻率較 MSI結腸癌高,且LOH陽性結腸癌甲基化程度明顯低于 LOH陰性結腸癌,同時低甲基化程度高的組織有更多的位點出現 LOH。

1.1.2 區域性高甲基化與結直腸癌 除整體基因組低甲基化外,基因 CpG島區域的異常高甲基化同樣在腫瘤發展過程中起重要作用,這也是目前研究的熱點,尤其是抑癌基因啟動子區域CpG島高甲基化導致的轉錄沉默更是倍受關注,這也很可能是癌性增生的最初表現。

p16基因是重要的細胞周期調控基因,能夠使細胞周期穩定在G1期,在多數胃癌和結直腸癌患者中表達下降。多數研究表明,除了少數為等位基因的純合性缺失外,啟動子的過度甲基化是p16失活的主要原因。大約 30%的結腸癌患者有p16基因啟動子的甲基化,而且p 16基因啟動子過度甲基化的大腸癌具有一些特殊的臨床病理特征,如多為右半結腸、女性和低分化癌。

hMLH 1是DNA錯配修復基因,大多數的遺傳性非息肉病性結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和部分散發性大腸癌(sporadic colorectal cancer,SCRC)(10% ～15%)表現為 MSI,但兩者發生 MSI的原因卻不相同,前者是由于錯配修復基因的突變,而后者則主要是由于hMLH 1基因啟動子的異常高甲基化導致hMLH 1基因的沉默表達引起。研究顯示MSI(+)的SCRC中 hMLH 1基因啟動子過度甲基化的檢出率可高達 70%～90%[4],提示 hMLH 1啟動子的過度甲基化與hMLH 1蛋白的失表達關系密切。

p14也是細胞周期調控基因,其作用機制是與癌蛋白MDM 2結合,加速 MDM 2降解并促進 MDM 2與 p53分離,促其誘導p53基因下調功能減弱,恢復和穩定細胞 p53水平,增強p53在 G1S/和 G2/M的限制點效應,最終使細胞阻滯于 G1和(或)G2期。此為 p14-MDM2-p53通路學說,即 p14和 p53之間為負相關,p 14的降低可導致p53的異常升高,從而在結直腸癌中發揮作用。p14可以通過等位基因的純合性缺失或基因啟動子的過度甲基化而失活,研究顯示近 1/4的大腸癌發生p 14基因啟動子的過度甲基化,且 p14啟動子甲基化可能為潰瘍性結腸炎相關的大腸癌發生過程中的常見的早期分子事件。Kom inami等[5]的研究表明在大腸癌中 p14基因啟動子過度甲基化與MSI關系密切,p14基因啟動子過度甲基化的大腸癌更常表現為MSI-L,提示p14基因甲基化可能參與低微衛星不穩定性結直腸癌的發生和發展。

APC基因作為結直腸癌的“看門基因”,負責大腸上皮細胞的自穩定,是結直腸癌發生的限速因子,家族性腺瘤性息肉病(fam ilial adenomatous polyposis,FAP)便是該基因突變或丟失引起的,同時在無家族史的結直腸癌患者中 35%～60%也存在該基因的丟失。除了基因的改變外,APC基因啟動子高甲基化導致的失活在人類腫瘤中也很常見。Arnold等[6]發現,染色體 5q上發生 LOH并且 APC表達降低的散發性結直腸癌病例,其APC啟動子發生高甲基化的頻率明顯高于染色體 5q上發生LOH但APC表達正常的病例。目前認為,與 5q雜合性丟失相比較,APC啟動子異常高甲基化在結直腸癌APC失活機制中可能起著“二次打擊”的作用。

RASSF1A基因是 Ras基因超家族的成員,發揮著抑癌基因的作用。2000年,Dammann在肺癌細胞中發現 RASSF1基因。其后的研究表明 RASSF1A啟動子甲基化導致的表達缺失與多種腫瘤的發生有關[7]。Wagner等[8]發現,45%(13/29)的結直腸癌病例發生了 RASSF1A基因啟動子甲基化,而其 3p21.3等位基因丟失卻并沒有檢測到。這表明RASSF1A基因啟動子異常甲基化而失活在結直腸癌中是很常見的事件,目前認為,RASSF1A的失活主要是因為啟動子的甲基化而非突變導致。

E-cadherin(上皮鈣黏素)存在于正常細胞膜表面,是調節細胞與細胞,細胞與細胞外基質之間黏附反應的重要媒介,在大多數腫瘤組織中則低表達或失表達,與腫瘤的侵襲有著密切的關系,造成E-cadherin表達降低的主要原因是其基因CDH 1啟動子 CpG島的高甲基化。Wheeler等[9]應用甲基化特異性 PcR法檢測 28例結腸癌上皮鈣黏素基因啟動子區 CpG島甲基化狀況,發現 46%發生了甲基化,基因啟動子甲基化與上皮鈣黏素表達降低顯著相關。目前的研究表明,E-cadherin還能與 βcatenin在細胞膜上形成 E-cadherin/β-catenin復合體,通過結合β-catenin阻止其進入細胞核內從而阻斷其對下游靶基因的激活而抑制細胞生長和增殖,并促進細胞的凋亡[10]。

1.2 組蛋白修飾與結直腸癌

真核細胞的基因組DNA在細胞核里是以染色質存在的,染色質是由 DNA、組蛋白、非組蛋白及少量的 RNA組成。組蛋白的 N-末端可通過乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等進行翻譯后修飾,不同的組蛋白 N-末端有不同的氨基酸(如組蛋白 H 3末端含 7個 Lys和 2個 Ser,H 4末端含 5個 Lys和 1個 Ser),組蛋白的任何 1種修飾都有可能改變組蛋白和各種染色質相關蛋白的親合力,影響核小體、染色質的高級結構,進而影響基因的轉錄。其中以乙酰化和甲基化修飾尤為重要。

1.2.1 組蛋白乙酰化 組蛋白乙酰化是組蛋白修飾中研究最多、最透徹的,乙酞化修飾大多位于組蛋白H 3中的第 9,14,18,23位賴氨酸,組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)或組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同介導的 1個可逆的動態平衡過程。HAT的作用是將乙酰輔酶 A的乙酰基轉移到核心組蛋白N-末端特定賴氨酸殘基上,消除了氨基酸殘基所帶的正電荷,使DNA構象展開、核小體結構松弛,從而促進轉錄因子和協同轉錄因子與 DNA結合,激活特定基因的轉錄;而HDAC則是去除賴氨酸殘基上乙酰基的作用,恢復組蛋白的正電性,增加組蛋白與帶負電的DNA間的吸引力,從而阻止轉錄調控元件靠近啟動子而達到抑制基因轉錄的作用[11]。組蛋白的這種乙酰化與去乙酰化的動態失衡將會影響基因轉錄水平,從而影響細胞的分裂、分化與凋亡,在惡性腫瘤的發生發展中可能起著重要作用。在人結腸癌細胞系 SW 1116和人直腸癌細胞系 Colo-320中,HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丁酸鈉通過抑制HDAC,增強乙酰化水平顯著上調p21WAF1基因的轉錄,其細胞周期亦被阻滯于G1期[12]。粗纖維食物可降低結直腸癌的發生率原因可能與其中大量的丁酸鹽等短鏈脂肪酸上調p 21WAF1等抑癌基因啟動子區相關的染色體組蛋白乙酰化有重要關系。

1.2.2 組蛋白甲基化 組蛋白甲基化修飾是重要的組蛋白修飾機制,它被認為是染色質是否具有活性的標志。甲基化修飾的部位主要是組蛋白H 3和H 4的賴氨酸和精氨酸兩類殘基,單個賴氨酸或精氨酸最多可被 3個甲基修飾。組蛋白甲基化和DNA甲基化可聯合作用共同參與抑癌基因沉默而誘發腫瘤。

p53基因是發現最早的抑癌基因之一,參與細胞周期調節、DNA修復、控制細胞增生和凋亡。p53功能缺陷的細胞不能誘導腫瘤細胞凋亡,也不能控制腫瘤細胞的生長。目前發現組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histone lysine methyltransferases,HKMTs)Set9、Smyd2和 Set8能夠甲基化 p53蛋白而(抑制其活性)調節其功能。甲基化位點分別為 p53K 372、p53K 370和p53K 382[13～15]。同時研究發現組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶 1(lysine-specific demethylase 1,LSD 1)也能使 p53蛋白 K 370位點發生特異性去甲基化而抑制p 53的功能[16]。

1.2.3 組蛋白磷酸化 組蛋白的磷酸化修飾主要參與細胞信號通路的活化。ERK-MAPK途徑和p38-MAPK途徑的激活能引起組蛋白H 3的Ser-10磷酸化,Ser-10的磷酸化在真核生物的基因轉錄活化中起重要作用。ATM/ATR和 DNA-PK通路激活能夠引起組蛋白H 2A變異體 H 2AX的 Ser-139磷酸化,后者參與DNA損傷的修復。

1.3 基因組印跡

基因組印跡是近年來發現的 1種不遵從孟德爾定律的,依靠單親傳遞某些遺傳學性狀的現象,即某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達,另一等位基因則不表達,當這些基因出現遺傳印跡丟失(LOI)時就會出現 2個等位基因的同時表達導致腫瘤發生,葡萄胎和畸胎瘤就是遺傳印跡丟失引起的腫瘤。在對基因組印跡的研究發現胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF2)基因印跡丟失在結直腸癌的發生中有著重要的意義。IGF2屬于癌基因,是第 1個被證實的內源性印跡基因,IGF2基因具有促生長的作用,當其發生基因印跡丟失而使雙等位基因同時表達時就會促成腫瘤細胞的異常生長。Cui[17]的研究指出 IGF-ⅡLOI在結直腸腫瘤的早期診斷、預防及療效監測方面具有重要意義,可作為結直腸癌發生危險性的分子標記物。

2 表觀遺傳學在結直腸癌中的應用

2.1 表觀遺傳學在腫瘤早期診斷中的應用

由于表觀遺傳學可以將DNA、RNA以及蛋白表達等各個層面完整有機地結合在一起,通過對表觀遺傳學改變進行監測,可以對腫瘤的發生進行預測和診斷。目前應用較多的是對腫瘤DNA甲基化異常的檢測,這是因為,與 DNA變異相比,基因甲基化改變常是細胞癌變過程中更為早期的事件,因此可能在腫瘤早期診斷中具有更大的價值。甲基化特異性PCR(MSP)是目前檢測基因啟動子 CpG島甲基化中應用最廣泛的 1種技術,它是利用經重亞硫酸鈉處理后 DNA序列中甲基化和未甲基化CpG島的差異,然后設計出用于甲基化分析的特異性 PCR引物來進行檢測。大多數腫瘤都有多個獨立的啟動子甲基化事件,因此建立合理的多指標甲基化圖譜能為腫瘤風險評估、早期診斷以及腫瘤預后提供有用的信息。Leung等[18]發現檢測糞便中7個基因(APC、ATM、hMLH 1、SFRP2、 HLTF、MGMT和 GSTP1)的甲基化診斷大腸癌和腺瘤的敏感度分別為 75%和 68%,特異度為 90%。

2.2 表觀遺傳學在腫瘤治療中的應用

與遺傳學改變不同,表觀遺傳學改變是可逆的,通過糾正表觀遺傳改變為腫瘤的治療提供了個新的途徑,使其成為潛在的腫瘤治療靶點。大量研究表明 DNA甲基化轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑對腫瘤具有明顯的治療作用,但由于缺乏特異性和一定的毒副作用在臨床運用上仍需進一步研究[19]。不過表觀遺傳學引起的基因功能異常存在多種機制且相互作用,也提示聯合治療可能將是個很好的治療策略[20]。

總之,表觀遺傳學的研究使我們對結直腸癌的發生、發展不再拘泥于基因水平的改變。基因后修飾的異常在腫瘤的發生、發展中可能具有更為普遍和重要的作用。相信隨著對其機制的進一步闡明,表觀遺傳學將為研究結直腸癌的發病機制提供更開闊的思路,并在結直腸癌的診斷、治療和預防等多方面發揮極為重要的作用。

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