eIF4E與細胞周期調節基因的關系

高 敏綜述 胡新榮審校

真核細胞中,翻譯的調節在基因表達的調控方面有非常重要的作用,而翻譯的調節首先出現在翻譯的起始階段。真核細胞翻譯起始因子 4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)是胞質中 mRNA翻譯的最有效的限速調節因子[1],在蛋白質合成的起始階段起重要的調控作用。在細胞核中,eIF4E的功能是使特定的生長調節mRNA完成核質轉運。eIF4E不僅對于細胞的蛋白合成、增殖和惡性轉化具有重要作用,而且還涉及到細胞周期的進行、細胞凋亡的抑制及癌的生成、浸潤和轉移[2,3]。本文就 eIF4E與細胞周期相關基因的關系給予綜述。

1 eIF4E

1.1 eIF4E的基因定位與結構特點

eIF4E是新近發現的 1個原癌基因,人eIF4E基因定位于染色體 4q21-q25,其堿基序列 ＞50 kb,包括 7個外顯子,6個內含子。eIF4E基因編碼 24 kD的多肽,以游離或復合物的形式存在于胞質中,部分位于細胞核。真核 mRNA 5'帽子結構(m7GpppN)與 eIF4E空間表面凹陷的疏水口袋中 2條 8個色氨酸組成的保守殘基結合,形成三明治夾心結構。eIF4E背面空間凸起與真核細胞翻譯起始因子4G(eukaryotic translation initiation factor 4G,eIF4G)或其翻譯的抑制蛋白特異結合。eIF4E在細胞質中參與mRNA向 43s起始復合物的轉運以形成48 s復合物,并幫助解開 mRNA 5'非翻譯區(5-untranslated terminal regions,5'UTRs)的二級結構,這些是起動 mRNA翻譯的關鍵步驟。大約 68%的eIF4E以離散的球形結構存在于細胞核中,稱之為 eIF4E核體。近來發現 1種新的核漿穿梭蛋白 4E-T[4](eIF4E-Transportor),可以介導 eIF4E進入核內。在核內 eIF4E則選擇性轉運特殊 mRNA,如 VEGF、cyclinD1和 ODC(鳥氨酸脫羧酶)到細胞質而不影響看家基因mRNA如 GAPDH和actin的轉運或改變其轉錄水平。

1.2 eIF4E的生物學作用

mRNAs在其帽子結構和啟始密碼子(AUG)之間存在未結構化的 5'UTRs。90%的 mRNA的 5'UTRs少于 200個核苷酸序列并缺少上游的 AUG,這類mRNA容易競爭到翻譯啟始因子而被有效翻譯,故被稱為強m RNA,主要編碼管家蛋白質;相反弱的mRNA包含長的 GC豐富 5'UTRs,具有起穩定作用的二級結構而通常不被翻譯。這些弱 mRNA編碼的往往是一些與癌密切相關的調節蛋白,例如細胞周期調節蛋白 c-myc、ODC和cyclinD1;促進細胞生長和血管生成的蛋白 FGF-2和 VEGF;以及促進腫瘤細胞浸潤和存活的蛋白 MMP9和 Bcl-2等。在腫瘤細胞中,eIF4E的過表達能打開這種長而高度結構化的 5'UTRs序列,大大提高了弱 mRNA的表達而僅輕微提高強 mRNA的表達,產生一些促進細胞生長和轉化及血管生成的調節蛋白來參與癌的形成和轉移[5,6]。研究發現,eIF4E在乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞中普遍過表達,其表達與多種實體腫瘤的發生、浸潤、轉移有關[7]。

1.3 eIF4E活性的調節機制

1.3.1 eIF4E自身磷酸化作用 eIF4E的活性受多種因素的調控,自身的磷酸化是其激活的 1種調節方式。eIF4E主要的磷酸化位點是 Ser53,Ser209位點的磷酸化也可提高 eIF4E的活性,eIF4E磷酸化后與 mRNA的親和力明顯增加。此外,eIF4E的磷酸化水平受一系列細胞外信號刺激的影響:激素,生長因子,細胞因子,有絲分裂原等均可以導致eIF4E磷酸化。

1.3.2 eIF4E結合蛋白 4E-BPs的調節作用 eIF4E能否成為有功能的翻譯因子還受到 eIF4E結合蛋白(eIF4E binging proteins,4E-BPs)調節。4E-BPs有保守的 eIF4E結合位點TyrXXXXLeuφ(x代表任意氨基酸,φ代表任意疏水氨基酸)[8],4E-BPs通過這個位點與 eIF4E背面結合。目前研究最清楚的是 4E-BP1,主要通過磷酸化來調節 eIF4E的活性。當 4E-BP1磷酸化時釋放 eIF4E,使之與 eIF4G、eIF4A形成翻譯起始復合物,提高蛋白質的翻譯效率。當 4E-BP1低磷酸化時與 eIF4E結合,從而限制了帽依賴翻譯的起始[9]。一般來說,作為競爭性抑制者并不干涉eIF4E與 5'帽子結構結合,而是與eIF4G競爭eIF4E識別位點,這種競爭作用是通過 4E-BP1的分級多位點的磷酸化來調節的。

1.3.3 細胞核蛋白的調節作用 細胞核內eIF4E的活性調節已經越來越清楚了。迄今為止,有 2個負調節蛋白PML(promyelocytic leukem ia protein)和PRH(proline-rich homeodomain protein)已經確定。PML主要定位在多蛋白核底物復合體中,被稱為 PML核體[10],在細胞核中與 eIF4E核體共存。通過 RING結構域與 eIF4E的背部結合,誘導其產生構象變化而發揮作用[11]。PML抑制 eIF4E活性,降低 eIF4E與 mRNA 5'帽的親和性。PRH是 1個同源結構域蛋白,在其氨基末端有 1個與eIF4E作用的保守結合位點[12]。PRH過表達可以引起大部分eIF4E核體的破壞,阻礙 eIF4E依賴的 mRNA核質轉運功能。而PML過表達不會破壞eIF4E核體,只會導致更大的核體定位于原處,且 PML并沒有保守的 eIF4E結合位點。另外,Topisirovic等[13]研究發現同源結構域蛋白 HOXA 9是 eIF4E依賴的核質轉運的 1個正調控因子,它也是通過保守的 eIF4E結合位點直接與eIF4E背側結合,上調細胞增殖相關的cyclinD 1mRNA的核質轉運。

1.3.4 降解 eIF4E主要是 159-賴氨酸殘基易泛素化,并通過蛋白酶體依賴的途徑蛋白水解泛素化的 eIF4E。泛素化的eIF4E保存有帽結合能力,但eIF4E的磷酸化以及與 eIF4G的結合能力明顯降低[14]。

2 eIF4E與細胞周期相關基因的關系

eIF4E的活性在細胞周期調節過程中起重要作用,特別是G1/S期,蛋白合成是進入細胞周期和細胞周期過渡所必需的。eIF4E處于該關卡的中心環節,與cyclinD 1,c-myc,p53等形成復雜的反饋調節網絡。

2.1 eIF4E與 cyclinD1

真核細胞分裂增殖必須通過 2個關鍵的細胞周期調控點:G1/S和 G2/M關卡調控點,由 cyclins-CDKs激酶復合物的有序激活和失活進行調控。cyclins-CDKs激酶活性受多種因素調節,cyclin為其正向調節因子。cyclinD 1與細胞周期蛋白依賴性激酶 4和 6(CDK4 and CDK6)結合形成活化的復合物,通過磷酸化和失活 pRb來啟動細胞周期進程[15]。cyclinD1水平在G1期開始升高直到 G1/S期交界迅速下降,在G1/S轉換過程中起重要的調控作用[16]。cyclinD1是生長因子的感受器,其基因表達受生長因子通過絲裂原刺激等誘導。

Rosenwald等利用 Northern和westernblot發現在纖維母細胞中過度表達 cyclinD 1mRNA,并沒有增加 cyclinD1蛋白的表達。相反過度表達的 eIF4E導致 cyclinD1蛋白水平的顯著增加,而其 mRNA水平無明顯改變。與 pRb,actin以及 eIF-2a相比這種增加是 cyclinD1特有的,提示cyclinD 1的調控可能存在轉錄后的機制。Rosenwald等隨后的研究發現:外生性過表達的cyclinD 1mRNA積聚在細胞核。在 eIF4E過表達的細胞,cyclinD 1mRNA胞質/胞核率增加。表明 eIF4E所肩負的轉錄后角色,是轉運cyclinD 1mRNA從細胞核到細胞質的多聚核糖體。GC豐富的 5'UTRs和可能的二級結構在此調節過程中似乎并沒有起到關鍵作用。因為 eIF4E突變型W 73A不能與eIF4G結合,因此不能作用于翻譯卻保留mRNA的輸出活性,說明翻譯和核質轉運功能是解偶聯的[17]。Culjkovic等[18]發現 eIF4E在調控細胞核 mRNA與細胞質mRNA存在本質的不同。在細胞質,識別 5'm7G帽結構足夠 eIF4E與 mRNA的相互作用;相反的,在細胞核 eIF4E促進 cyclinD 1的 mRNA核輸出,而不是GAPDH或者 actin。這種相互作用的差別基礎是在 cyclinD 1 mRNA 3'UTRs約 100個核苷酸序列,稱為 eIF4E敏感元件。cyclinD 1mRNA富集于eIF4E核體,在 eIF4E核體內及其周圍組裝運輸到多聚核糖體。

2.2 eIF4E與 c-myc

c-myc基因編碼 49 KD蛋白質,位于細胞核內,是 1種轉錄因子。c-myc蛋白與 Max形成異源二聚體后,再與特異的 DNA序列(CACGTG)結合,從而活化靶基因轉錄。試驗表明[19]向mycer細胞(它能表達c-myc與雌激素受體相融合形成的嵌合蛋白質),添加雌激素 4～8 h后,蛋白質的合成開始增加,24 h后DNA開始復制。這與進入S期需要蛋白質的合成增加的要求相一致。當c-myc等位基因雜合性缺失時,c-myc表達減半,細胞延遲3 h進入S期,DNA復制時間也同樣延長。c-myc是細胞周期機制的直接調控者,它處在生長和細胞周期控制的交匯點。

c-myc能夠控制 DNA復制,當失控時,同一機制還能引起DNA損傷和促進細胞增殖,從而引起腫瘤發生。eIF4E是c-myc轉錄調節的僅有的幾個靶點之一,c-myc直接活化 eIF4E的轉錄,這種轉錄作用是由在啟動子區域存在保守的 E-boxes(5'CACGTG 3')介導的[20]。此外,c-myc阻止 Mad1下調 eIF4E的表達;增加 eIF4E的水平,可以刺激 c-mycmRNA的核輸出及翻譯。c-myc與 eIF4E之間存在正反饋環起到連接轉錄與翻譯的作用,并有利于c-myc在細胞增殖和腫瘤生長過程中的作用。Ruggero等[21]認為 eIF4E和 c-myc在 B細胞淋巴瘤的形成過程中有協同作用,共同促進 B細胞淋巴瘤的增殖。

2.3 eIF4E與 p53

腫瘤抑制因子p53蛋白可以使受損的哺乳動物細胞停滯在G1期,在 G2期停滯中也起作用。p53在正常情況下,由蛋白酶體持續降解維持低濃度[22]。損傷的 DNA等刺激使p53蛋白穩定,導致其濃度的升高。p 21是細胞周期蛋白-激酶抑制因子(CKIs)屬于CIP/KIP家族。p21啟動子上有 p53的結合位點,是p53刺激轉錄的基因之一。

盡管eIF4E在控制細胞增殖和轉化的蛋白翻譯的作用已經確定,但是 eIF4E的表達調控還沒有完全搞清。雖然先前的研究表明c-myc激活 eIF4E的轉錄表達,Zhu等[23]首次表明 p53抑制eIF4E的轉錄。eIF4E的啟動子不包含 p53的效應元件。CHIP分析檢測到p53抑制eIF4E的啟動子的活性,與先前的觀察,p53負調節缺乏直接的 DNA綁定序列基因啟動子相一致。可能機制p53與c-myc基因相結合,使之與真核翻譯起始因子eIF4E結合減少,從而抑制了 eIF4E基因轉錄和蛋白翻譯。此外,活化的 p53能夠引起 4E-BP1去磷酸化,從而使 eIF4F復合物的形成減少抑制蛋白合成[24]。基因突變或者過表達 MDM 2失活p53,導致eIF4E介導的腫瘤相關基因翻譯增強。因此,失活p53轉錄誘導 eIF4E可能是新的通路有助于腫瘤形成和發展。

2.4 eIF4E與 ODC

ODC是 2個相同的亞基聚合而成有活性的寡聚酶,每個亞基由 461個氨基酸組成。ODC廣泛分布在人體內,其功能是催化鳥氨酸脫羧生成腐胺,是多胺代謝的限速酶。細胞內多胺的濃度可上調或下調細胞周期的重要檢驗點,所以在整個細胞周期過程中存在 ODC和多胺濃度的變化。ODC第 1個高峰期發生在G1期,隨后伴隨多胺濃度的升高,在 G2期有絲分裂前ODC出現第 2個高峰。ODC活性升高是細胞刺激生長后觀察到的早期變化之一,這種升高是發生在DNA合成前幾個小時,這使得 ODC成為“早反應基因”。

經研究發現 ODC mRNA的核質轉運以及翻譯起始均依賴eIF4E。在細胞中,eIF4E過表達導致ODC在蛋白水平表達升高30倍,同樣的,用反義 RNA減少 eIF4E的表達可以抑制 ODC mRNA翻譯[25]。Shantz[26]研究表明 Raf/MEK/ERK和 PI3K信號通路是誘導 ODC活化所必需的。ODC的轉錄由 Raf/MEK/ERK通路的活化控制,對于 ODC翻譯的調控,則是由 Raf/MEK/ERK和 PI3K通路共同調節。ODC的合成增加伴隨eIF4E和 4E-BP1的磷酸化改變,PI3K通路磷酸化 2種蛋白,而 Raf/MEK/ERK通路僅影響eIF4E的磷酸化。磷酸化的 eIF4E可能對新合成的 RNAs的翻譯是重要的,如 ODC。其磷酸化的數量主要影響 ODC的翻譯效率。人ODC基因含有 3個CACGTG區域:1個在 5'啟動子區域,另兩個在第一內含子區,他們可以與癌基因c-myc的蛋白產物相結合。過表達c-myc導致ODC活性和凋亡升高,C-m yc是ODC表達的 1個調節因子。

3 eIF4E與腫瘤

近年來研究顯示,eIF4E過表達與腫瘤的發生發展關系密切。eIF4E通過多方面調控惡性腫瘤相關mRNAs的翻譯,包含細胞有絲分裂過程、激活原癌基因、血管形成、增強自分泌、細胞存活、侵襲及與細胞外環境的交通[27]。

相對于正常組織而言,eIF4E在大多數的頭頸部鱗癌標本中有 3～24倍的表達升高,這與 eIF4E的基因擴增有關[28]。Haydon等[29]使用競爭性 PCR和 Western blot方法檢測頭頸部良惡性腫瘤中 eIF4E的表達情況,發現eIF4E基因的擴增和過表達隨著惡性程度的增加而增加。Flowers等[30]檢測 103個雌激素受體(estrogen receptor ER),孕激素受體(progesterone receptor PR),和 HER 2/neu receptor陰性的乳腺癌患者 eIF4E的表達水平,發現eIF4E的表達水平越高,腫瘤的復發率和腫瘤相關的死亡率越高。有研究報道[31],隨著宮頸腫瘤(CIN和宮頸癌)惡性程度的增加,eIF4E表達的遞增。在正常宮頸鱗狀上皮組織中未檢測到 eIF4E的表達;隨著宮頸上皮病變級別的升高,從低級別到高級別的CIN,特別是侵襲性的宮頸癌,eIF4E表達逐漸增強。

綜上所述,研究證實eIF4E處于細胞周期調控的中心環節,在細胞生存和基因表達的調控中發揮重要作用,對其調控途徑的研究成為分子生物學的活躍領域。eIF4E基因的突變或過表達促進各種癌蛋白和促癌因子的表達增強,與人類多種腫瘤的發生關系密切,是 1種重要的原癌基因 。隨著對 eIF4E基因結構的闡明,其翻譯調控機制與 eIF4E調控細胞的機制均得以初步闡明。人們對 eIF4E調控細胞周期的確切機制以及與腫瘤發生關系的認識,將有助于進一步了解細胞生長與分化機理,并為最終攻克癌癥奠定基礎。

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