亞甲藍、納米活性炭及中華墨汁作為胃癌淋巴結示蹤劑的效果比較

童朝剛 陳曉鵬

染料示蹤法是淋巴結顯像的主要方法之一[1],染料的選擇是影響淋巴結顯像效率的重要因素之一，選擇理想的染料可進一步提高淋巴結檢出率。國內外常用的染料示蹤劑有亞甲藍、納米活性炭、中華墨汁等。本實驗在建立鼠種植性胃癌模型基礎上，應用上述幾種常見染色顯像劑，探討它們在胃癌中的顯像效率并進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Walker-256腫瘤細胞株 由南京中醫藥大學中醫藥研究院提供。

1.1.2 動物 健康SD雌性大白鼠40只,鼠齡6～8周,體重140～180 g,均由南京青龍山動物繁殖場提供(批號：SCXK20060003)。

1.1.3 主要試劑 ①納米炭混懸注射液(商品名：卡納琳)，由重慶萊美藥業有限公司生產，批準文號：國藥準字H20073246。②亞甲藍注射液，由江山濟川制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H32024827。③中華墨汁原墨,北京一得閣工貿中心生產,小瓶分裝經高溫高壓消毒后密封備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物胃腫瘤模型的制作方法 (1)鼠腫瘤性腹水模型的制作:將冷存的Walker-256細胞株復蘇后,取0.1～0.2 ml(含細胞約106個)注入SD雌性大鼠腹腔內,清潔條件飼養,5～7 天即可形成鼠腫瘤性腹水模型。然后抽取腹水約 2 ml注入另一只大鼠腹腔，約5 d即可再次形成傳代腹水模型。(2)鼠種植性胃腫瘤模型的制作:①從傳代的大鼠腹腔抽取癌性腹水5 ml,呈淡紅色洗肉水樣,鏡下可見大量瘤細胞。將抽取的腹水離心(1 000轉/分)5 min，離心完成后,棄去上層淡色較清亮的癌性腹水,保留下層較濃稠呈稀糊樣的半液態物，再以生理鹽水調整細胞濃度為1×107個/ml,即為腹水瘤細胞懸液，于冰塊上低溫放置備用。②36只SD大鼠以25%烏拉坦0.4 ml/100 g腹腔麻醉,仰臥位,四肢固定于手術臺上,腹部碘伏消毒取上腹正中切口，長1～1.5 cm，沿腹白線逐層進腹,無菌紗布保護切口，暴露鼠胃前壁,于胃竇區前壁近小彎側漿膜下注入腫瘤細胞懸液約0.2 ml(勿刺破黏膜層)。拔針后,助手立即用棉簽按壓穿刺點2～5 min后,觀察沿針道無活動性出血后,輕送胃還納腹腔,逐層關腹,鹽酸金霉素眼膏外涂防止感染。術后7天沿原切口進腹觀測腫瘤的生長情況,并取少許腫瘤組織病理學檢查。

1.2.2 胃癌淋巴結的染色示蹤法 取36只腫瘤模型大鼠隨機進入3組，即亞甲藍組、納米活性炭組、中華墨汁組。各組大鼠腹腔麻醉固定后，沿原切口進腹，可見胃竇區小彎側結節型腫塊，直徑在0.5～1.0 cm不等，采用腫塊周圍4象限各注射1點的方法，每點染色劑注入量為0.1 ml，在5 s內勻速注入。然后觀察各組染料到達第1、2站淋巴結的時間、淋巴結的檢出枚數及褪色時間。縫合切口,分別于術后1天、14天再次進腹觀察各組淋巴結褪色情況。飼養2周后處死，切取肺臟、肝臟及腎臟送病理學檢查。各組動物在注射前和飼養1周后,各抽取靜脈血檢測谷丙轉氨酶、尿素氮和肌酐。

1.3 統計學方法

每個指標經方差齊性檢驗后，行完全隨機設計方差分析，每兩組間的比較采用Student-Newman-Keuls法，所有檢驗的顯著性水平(α)取0.05雙側,使用SPSS13.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 染料在胃周淋巴系統中運行的動力學指標

注入染料后，各種染色劑到達第1站淋巴結所用的平均時間，亞甲藍組為(14.33±2.22) s,納米活性炭組為(4.11±1.59)min、中華墨汁組為(20.00±8.53)min。染料運行至第2站淋巴結的平均時間，亞甲藍組為(21.88±2.38) s,納米活性炭組為(13.75±4.61)min，中華墨汁組為>1 h。記錄數據經統計分析可知,不同染料間在到達1及第2站淋巴結時間上差異有統計學意義(P=0.00)，三者在顯像時間上差異明顯，亞甲藍組淋巴結較活性炭組顯像快(P<0.05)，但中華墨汁明顯長于前兩者。實驗中，還觀察到2例淋巴結的跳躍性轉移現象，即第2、3站淋巴結先于第1站顯像。

2.2 染色淋巴結的檢出枚數

實驗中，我們在注射染料示蹤劑后每隔10 min連續觀察1 h，必要時借助雙目手術顯微鏡記數顯像淋巴結的總枚數。各組檢出枚數亞甲藍組為 (7.83±1.75)枚,納米活性炭組為(7.25±1.77)枚,中華墨汁組為 (2.17±0.84)。組間比較：亞甲藍組與納米活性炭組間差異無明顯統計學意義(P=0.352)，即兩者在淋巴結顯像枚數無明顯差異；但中華墨汁在實驗時間內顯像淋巴結數明顯少于前兩者(P=0.00)。

2.3 染色淋巴結的褪色時間

實驗中，我們每隔10 min肉眼觀察，以第1枚染色的淋巴結從著色到完全褪色的時間為褪色時間指標。亞甲藍組淋巴結(102.08±10.74)min完全褪色，實驗2 h內，活性炭組及中華墨汁組第一枚染色淋巴結均未完全褪色。術后1天再次進腹觀察，活性炭組首先染色淋巴結已完全褪色，而墨汁組仍黑染。對比注射部位,亞甲藍及活性炭組藍染組織在14天已明顯褪色,墨汁各組注射部位仍明顯黑染。

2.4 不良反應

觀察期間各組實驗動物均無明顯不良反應發生,實驗前后血液學肝腎功能主要指標檢查無明顯變化，送檢的內臟器官組織學檢查也未見明顯的病理學改變。

3 討論

本實驗參照文獻方法[2]利用Walker-256細胞株成功地復制出種植性胃腫瘤模型,此法具有制作簡便,重復性及穩定性好的優點,實驗中之所以選用胃小彎側近胃竇旁為種植部位，因為此處血液供應豐富，腫瘤細胞生長迅速，成瘤效率高,可為我們實驗研究提供1種很好的胃腫瘤模型。

目前，淋巴結的示蹤法主要有染料法、核素法及兩者的聯合應用[3]，其中染料法以其不需昂貴儀器、無放射性污染、操作簡單、易于被患者接受等優點可能在我國(尤其在基層)更具有良好的推廣應用前景。各種示蹤法在乳腺癌、黑色素瘤、結直腸癌已有廣泛應用并日趨成熟[4，5]。但目前在胃癌中的應用尚不多見，多在術前內鏡下或術中注射染料[6]，以顯示淋巴回流示蹤淋巴結，指導淋巴結清掃。然而，染料的選擇可直接影響顯像的效率及淋巴結的清掃徹底性。常用的活性染料有亞甲藍、專利藍、墨汁、吲哚菁綠、微粒子活性炭等[1，7]。 好的活性染料示蹤劑應具備:①淋巴組織吸收快,并能清楚顯示淋巴管和淋巴結;②最好僅在淋巴結中聚積并停留較長的時間;③成本低、無毒性。幾種最常使用的染料中究竟那1種最符合以上條件尚有較大爭議,為之我們建立動物模型,采用統一的研究方法對它們在胃癌淋巴結中的顯像效率進行系統研究。

本實驗顯示，注射亞甲藍后數分鐘內，胃前、后壁及小彎側可見3～4條細小藍染淋巴管顯影,借助手術顯微鏡，甚至1 mm以下的淋巴結染色后都清晰可見，能滿意顯示胃癌周圍淋巴結分布情況,增加淋巴結檢出數目。根據染色情況及染色的先后順序,在實際中可為手術根治及淋巴清掃提供條件。這與亞甲藍的生物學特性有關[8]，其為水溶性色素，分子量小，滲透性強。局部注射后容易隨水和大分子進入淋巴回流，從而顯示出注射部位的淋巴引流途徑。由于其良好的滲透性，淋巴結不論有無癌轉移，皆可使之著色，而活性炭對于有癌栓阻塞嚴重的淋巴結則難以顯色。此法的優點是簡便易推廣且較為安全,藥品來源廣泛，價格便宜，無需特殊處理，即可使用，但實驗顯示其仍存在著許多問題:染色快,色素消失也快，染色在1 h內最明顯，必須在限定的時間內觀察，故不適于術前內鏡下染色及時間較長的手術。

納米碳混懸注射液(CH40)在日本全國范圍內廣泛使用已逾十多年[9]，有大量臨床應用文獻報道，認為有助于提高惡性腫瘤淋巴結清掃的數量，降低局部復發率，提高生存率，而沒有任何關于長期毒性的報道，國內也有類似報道[10，11]。目前，卡納琳(商品名)為我國國內唯一上市的納米碳混懸注射液，由重慶萊美藥業有限公司生產，為活性炭經納米技術處理，其團粒微小、均勻，平均粒徑為150 nm，注射到腫瘤局部組織后，可被巨噬細胞吞噬，具有高度的淋巴系統趨向性。本組實驗顯示，其同亞甲藍一樣可顯像淋巴結，但在到達第1、2站的時間及褪色時間上明顯長于前者，其染色程度更深。實際手術中，這些黑染淋巴結的存在可刺激外科醫生清掃更多的淋巴結，對重點部位進行更精細徹底的清掃；還可以提供術者視覺上的提示，避免重要血管的損傷。所以，納米炭示蹤效果較理想，但是價格上千元，限制了其應用。

我們在實驗中觀察到，中華墨汁擴散速度較慢,局部黑染嚴重，淋巴結顯示效果差，因為中華墨汁是由6%碳黑+85%水和一些穩定劑制成的,碳顆粒的直徑0.1～6.0 μm，大小不均勻，以大顆粒為主，局部注射后很難進入淋巴管，有些顆粒可造成淋巴管阻塞，使局部黑染嚴重，故示蹤效果差。說明墨汁的染色效果明顯不如亞甲藍和活性炭。但國內也見報道其可用于淋巴結的示蹤研究，這可能與其須調整至合適的濃度有關。

實驗中，還可見顯像淋巴結多位于第1、2站，提示胃癌的淋巴回流多在第1、2站，與胃癌標準的D2根治術相吻合。但部分也可見第3站淋巴結顯像，甚至在顯像順序上先于1、2站，這可用來解釋胃淋巴引流通路錯綜復雜,胃某一區域的淋巴回流并不一定按次序流經某一淋巴結,常出現跳躍轉移[12]。因此，顯像劑的應用對發現胃癌異常解剖部位的“跳躍性”轉移淋巴結,指導胃癌手術切除范圍有重要意義。

綜上所述，亞甲藍和活性炭在胃癌的淋巴結顯像效率上相仿，可作為淋巴結的示蹤劑，指導術中淋巴結的清掃范圍，但兩者各具優缺點，染、褪色時間上存在差異，提供給術者的時間活性炭要長于亞甲藍。中華墨汁的顯像效果不如前兩者。

[1] Zervos EE,Burak WE Jr.Lymphatic mapping in solid neoplasms:state of the art〔J〕.Cancer Control,2002,9(3):189.

[2] 陶凱雄,田 源,陳道達,等.鼠種植性胃腫瘤模型的制作方法及抗癌藥物的治療作用〔J〕.同濟醫科大學學報，2006,29(3):229.

[3] 程黎陽,陳曉東,張玉新,等.專利藍和放射物聯合示蹤檢測胃癌前哨淋巴結及其臨床意義〔J〕.中華外科雜志,2005,43(6):569.

[4] D Burbage,E Penman,D Dickson,et al.Evaluation of the sentinel lymph node mapping technique for breast cancer in a community-based teaching hospital〔J〕.ASCO Meeting Abstracts,2005,6(23):893.

[5] Matter M,Nicod Lalonde M,Allaoua M,et al.The role of interval nodes in sentinel lymph node mapping and dissection for melanoma patients 〔J〕.J Nucl Med，2007，48(10):1607.

[6] Saha S,Dan AG,Bilchik AJ,et al.Historical review of lymphatic mapping in gastrointestinal malignancies〔J〕.Ann Surg Oncol,2004,11(3):245S.

[7] Rino Y,Takanashi Y,Hasuo K,et al.,The validity of sentinel lymph node biopsy using dye technique alone in patients with gastric cancer〔J〕.Hepatogastroenterology，2007，54(78):1882.

[8] Jun Ho Lee,Keun Won Ryu,Chan Gyoo Kim,et al.Sentinel node biopsy using dye and isotope double tracers in early gastric cancer〔J〕.Ann Surg Oncol,2006，13(18):1168.

[9] Yokota T,Saito T,Narushima Y,et al.Lymph-node staining with activated carbon CH40:a new method for axillary lymph node dissection in breast cancer 〔J〕.Can J Surg,2000,43 (1):191.

[10] 戚曉東,王舒寶,齊春蓮,等.胃壁內注微粒子活性炭指導胃癌淋巴結清除術〔J〕.中華外科雜志,1993,31(5):284.

[11] 黃廣建,陳忠清,張延齡,等.胃癌病灶周圍注射超微活性炭對淋巴結的顯色效果〔J〕.中華醫學雜志,2004,84 (24):2070.

[12] Kitagawa Y,FujⅡ H,Mukio M,et al.The role of the sentinel lymph node in gastroin testinal cancer 〔J〕.Surg Clin North Am,2000,80 (6):1799.