建立小鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型手術技巧及 TTC染色方法探討

, ,,,,

(1華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院,武漢 430030;2美國俄亥俄州立大學醫學中心)

心臟缺血性疾病的發病率和致死率在世界范圍內呈增長趨勢[1]。心肌缺血再灌注(I/R)動物模型的成功建立為缺血性心臟病治療提供必需的實驗方法[2],其模型復制方法目前有兩種:無呼吸機支持胸腔外結扎和呼吸機支持改進的心臟原位結扎法[3,4]。2008年 12月～2009年 12月,本研究結合使用小鼠呼吸機,對心肌 I/R模型的手術技巧和注意事項進行簡述,以期熟練掌握手術方式,快速準確地建立高存活率動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型 C57BL/6雄性小鼠購買于Jackson實驗室 (美國緬因州 Bar Harbor),共 30只,其中 20只用于建立 I/R模型(實驗組),10只為假手術組。所有的實驗操作獲得美國俄亥俄州立大學動物保護和使用機構的許可,并且符合美國國立衛生研究院相關實驗動物使用和保護指導(NIH 85-23,1996)。

1.2 主要試劑及儀器 氯化三苯四氮唑(TTC,美國 Sigma公司)。藥品有氯胺酮、阿托品、甲苯噻嗪和異氟烷。小鼠通氣量呼吸機,心電圖監測儀,3-0和 7-0絲線,顯微外科手術器械,小動物體溫監測器,紅外線加熱器,心臟切片器,麻醉機,激光多普勒灌注檢測儀。MetaVue Version 6.2r6分析軟件,高分辨率解剖顯微鏡(Nikon,SMZ1000)。伊文思藍(Evans Blue,美國 Sigma-Aldrich公司)。

1.3 動物模型的改進 參考文獻[4,5]的方法并加以改進。具體方法如下:小鼠用氯胺酮(50 mg/kg)合并使用肌松劑甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉。為控制呼吸道分泌物,術前給予阿托品。待小鼠麻醉后,采用 PE-90號插管做氣管插管,采用內外芯結構,將插管套在內芯為 20 G鈍性鋼針外。肉眼直視觀察到氣管插管針進入氣管后緩慢推動至器官分叉上方,拔出內芯,與小鼠呼吸機連接。調節小鼠潮氣量維持在 250～300 ml/min,控制呼吸頻率在 110～130次/m in。采用紅外線體溫加熱器維持體溫在36.5～37℃。開胸手術:小鼠采用右側臥位,暴露左側腋窩,從左腋窩下緣做橫行切口至左胸骨旁剪開皮膚,距離胸骨中線約 2mm,整個橫行切口大約8mm,皮下血管電凝結扎止血。逐層分離,剪斷胸大小肌,適當電凝止血。暴露胸壁肋間隙,在第 4或第 5肋間隙鈍性分離肋間肌,進入胸腔。采用自制拉鉤,以四角撐開肋間隙暴露范圍 6～8 mm,可根據手術需要適當調整大小。剝離心包膜充分顯露左心耳及左心室。在左心耳與肺動脈圓錐之間,找到行于心肌內與心大靜脈走向一致的冠狀動脈左前降支(LAD),以 7-0無損傷縫針距離左心耳下緣 2mm左右穿過心肌表層,在肺動脈圓錐旁出針。待穩定 15 min后,在心臟表面結扎處放一長約 2mm,大小為10號的聚乙烯管,在其上作一活結以結扎 LAD,心電圖顯示 ST段弓背向上抬高,心臟表面相應區域原色變為蒼白表明缺血成功;在 30 min缺血后,PE管被移出,LAD重新開放,心臟表面由蒼白變為鮮紅表明心肌組織恢復再灌注。再灌注時間根據實驗需要可設置不同時間點;再灌注開始后,縫合肋骨,逐層縫合肌肉和皮膚。剪斷門齒掛線,松開四肢及尾部固定。待小鼠蘇醒四肢有力時,方可拔出氣管插管。根據 TTC染色需要,我們在再灌注后 24m in處死小鼠。假手術組開胸后,僅將縫針穿過 LAD,但不做結扎。

1.4 梗死面積計算 I/R 24 h后,采用腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉小鼠,剪開胸腔切取心臟,保留主動脈。將心臟保存于 4℃生理鹽水中,將 23號針頭置入升主動脈根部,不穿過主動脈瓣,結扎固定。準備 37℃ 3～4 m l的 TTC磷酸緩沖液(pH7.4),從主動脈緩慢灌注心臟,當心肌變為磚紅色時停止注射。重新結扎 LAD。然后通過主動脈均勻緩慢灌注約 2ml 2.5%的伊文思藍,并使心肌缺血區域面朝上,防止流出的藍污染心臟表面。待心臟變藍后停止灌注并用生理鹽水充分沖洗,清潔心臟表面并擠壓心臟以排除殘留于心腔中伊文思藍。充分吸干心臟表面和心腔中的生理鹽水,保存于 -20℃冰箱中。待心臟冷凍固定后,將心臟置于切片器中,從心尖開始連續切厚度為 1mm的切片,一共 5片。采用高分辨率解剖顯微鏡對每片心肌組織兩面進行拍照。采用 MetaVue Version 6.2r6分析軟件對切片分析,TTC染色后梗死區為白色,未梗死區為磚紅色,伊凡思藍染色后整片切片面積減去藍色區域為缺血危險區(AAR)。以 AAR/左心室區域(LV)百分比表示 AAR面積,梗死區/AAR百分比表示梗死面積。完畢后對每片心肌組織稱重。

2 結果

2.1 模型制備情況 實驗組因麻醉意外死亡 1只,成功率為 95%(19/20)。假手術組均存活。

2.2 心電圖 ST段變化情況 實驗組結扎 LAD后心電圖 QRS波高大增寬或 ST段弓背上抬,復灌后ST段下降 1/3以上,假手術組前后無變化。

2.3 梗死面積 經過 TTC和伊文思藍染色,實驗組和假手術組 AAR面積分別為(59.5±0.9)%、(60.7±1.1)%,P＞0.05;實驗組梗死面積為(32.2±0.7)%,假手術組無心肌梗死形成。

3 討論

I/R模型中采用無呼吸機支持胸外結扎法因心臟擠壓至胸腔外,嚴重影響心臟的電生理和泵功能,影響實驗結果的可靠性,尤其在心肌缺血預處理時,多次牽擠心臟導致死亡,造模成功率極低。在我們的實驗方法中,合理使用小鼠呼吸機,操作過程中心臟處于正常的解剖位置,對血流動力學及心功能影響較小,術后存活率顯著提高。

必要的設備支持,扎實的手術基本功及必要的手術技巧對成功建模有重要意義。我們還有如下體會:①肋間隙的選擇:肋間隙的選擇需要根據具體的實驗需要具體分析。如缺血前預處理模型的建立[4],因為短期內需要對心臟反復操作,并且操作位置主要在心耳下緣位置,所以相對單純 I/R模型,在開胸時應適當高出一肋間隙,于第 3肋間隙入胸。而在其他手術模型的建立,比如運用電子順磁共振技術監測心肌中氧分壓水平的實驗[6],因為需要在心肌中植入探針,我們選擇第5肋間隙進入胸腔。②結扎部位:在我們的手術過程中,一般以左心耳最下緣作為解剖標志點1,以肺動脈圓錐作為解剖標志點 2。在距離解剖位置點 1下方 2 mm左右進針,從解剖標志點 2出針。這樣避免了依靠肉眼尋找 LAD的主觀性,同時依靠固定的解剖位置,固定的入針出針部位,有效地控制缺血面積的范圍,模型重現性好。③進針深度:我們的經驗是當使用 7-0無損傷縫線的時候,進針深度 0.5～1mm,當針尖全部進入心肌組織后,通過腕關節的作用水平化弧,至肺動脈圓錐出,出針;同時,為防止心臟因受進針力量跟隨右偏,左手可持手術鑷以相反的方向控制心臟的偏移。④結扎松緊度:結扎時寧輕勿重,在手術過程中,只要缺血期間連同 LAD一起結扎的 10號聚乙烯小管沒有松脫,基本可成功建立缺血再灌注模型。如果用力過度會導致缺血后血管無復流現象,在 TTC染色切片中表現為整片心肌梗死。另外如果過度用力,會因縫線的切割作用撕裂上方的心肌組織。

TTC染色是作為判斷心臟受損程度重要方法,此類染料可以穿過細胞膜,可以進行灌注染色。在整個染色過程中我們需要注意的是灌注針不要進入心腔,停留在主動脈瓣上方即可。恰當的控制染料僅局限在 AAR而不滲透到正常的心肌組織中成為染色成敗的關鍵。我們的的經驗是通過簡單地觀察心外膜的染色情況和注意觀察 AAR與其他區域形成良好的界限時即停止灌注,同時應保證缺血區域面朝上,以防從心臟中流出的伊文思藍污染其表面,影響結果。整個染色灌注過程緩慢推入同時保證心臟充分灌注是成功的重要因素之一。

總之,我們的方法相對簡單且成功率高,是建立小鼠 I/R模型的理想術式,可供相關研究參考。

[1]Azfer A,Niu J,Rogers LM,etal.Activation of endoplas micreticulum stress response during the development of is chemic heart disease[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2006,291(3):H 1411-1420.

[2]Ferez Santander SM,Marquez MF,Pena-Duque MA,et al.Myocardial ischemic-reperfusion injury[J].Rev Exp Cardiol,2004,57(Suppl 1):9-21.

[3]汪謙.現代醫學實驗方法[M].北京:人民衛生出版社,1997:976-977.

[4]Zhu X,Liu B,Zhou S,et al.Ischemic preconditioning prevents in vivo hyperoxygenation in postischem icmyocardium with preservation of mitochondrial oxygen consumption[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2007,293(3):H 1442-1450.

[5]Zhao X,He G,Chen YR,et al.Endothelium-derived nitric oxide regulates postischemic myocardial oxygenation and oxygen consumption by modulation of mitochondrial electron transport[J].Circulation,2005,111(22):2966-2972.

[6]Xu Y,Liu B,Zweier JL,et al.Formation of hydrogen peroxide and reduction of peroxynitrite via dismutation of superoxide at reperfusion enhances yocardial blood flow and oxygen consumption in postische micmouse heart[J].JPharmacol Exp Ther,2008,327(2):402-410.