兔 VX2肝癌動物模型的建立*

楊 林,李祖茂,周翔平

(1.川北醫學院附屬醫院放射科,四川 南充 637000;2.川北醫學院附屬醫院病理科,四川 南充 637000;3.四川大學華西醫院放射科,四川 成都 610041)

原發性肝癌(p rimary hepatic carcinoma,PHC)的發病率在世界各地均呈上升趨勢,也是我國常見的惡性腫瘤之一。PHC手術切除率僅 20%,在 PHC的非手術療法中,介入治療占有及其重要的地位。如何提高肝癌介入治療的遠期療效仍是臨床面臨的重要課題。肝癌介入治療的實驗研究需要借助動物模型來完成。既往肝癌動物模型多采用化學藥物誘導法建立在大鼠身上,該法具有誘導時間長和成瘤率低等缺點。另外,采用大鼠肝癌動物模型進行數字減影血管造影(diagnostic digital subtraction angiography,DSA)及肝動脈化療栓塞(chemoembolization)治療的研究多需開腹行肝動脈插管,操作較為復雜,動物死亡率較高。兔 VX2腫瘤是由 Shope等[1]使用病毒在兔皮膚誘導出的乳頭狀瘤,經 72次傳代培養后,建立起來的鱗癌細胞株。由于兔缺乏針對該腫瘤的抗體,故此鱗癌極易在兔體內生長,常接種到兔的肝臟和腎臟等部位,制作原位腫瘤模型。本文介紹應用 VX2腫瘤組織塊制作兔移植性肝癌模型方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物:雄性新西蘭大白兔 26只(平均體重2.0 kg),由四川大學華西實驗動物中心提供(合格證號:10)。荷瘤兔由華中科技大學同濟醫學院馮敢生教授惠贈。

1.2 藥物:10%水合氯醛;安定(天津金耀氨基酸有限公司);8%硫化鈉;優維顯 300(廣州先靈公司);青霉素(華北制藥股份有限公司);慶大霉素(樂山三九長征藥業股份有限公司);聚維酮碘溶液(成都永安制藥有限公司)。

1.3 設備:PHILIPS Brilliance 64層螺旋 CT(荷蘭);MEDRADRSTELLANTTMCT 211高壓注射器(美國 MEDRAD公司);SIEMENS AXIOM Artis FA DSA(德國)。

1.4 肝癌動物模型的建立:腫瘤移植手術由同一組醫師(1名高年資外科主治醫師,2名住院醫師)進行。將大腿攜有 VX2鱗狀細胞癌的荷瘤兔全麻(10%水合氯醛 2.5ml/kg,安定 2.5mg/kg,腹腔注射),無菌條件下剝離腫瘤,切取靠近包膜的灰白色魚肉樣腫瘤組織,剔除壞死組織及纖維組織,用眼科剪將腫瘤組織剪碎至 2mm左右大小的瘤塊,置于盛有生理鹽水的無菌培養皿中備用。實驗兔全麻(用藥及劑量同前)后,仰臥固定于手術臺上,手術野常規剪毛,8%硫化鈉脫毛,消毒鋪巾,取上腹正中切口,長約 2cm,逐層切口開腹壁各層,暴露肝臟,以平鑷將肝左外葉拉出體外,于其組織較厚處,以眼科剪作一長約 3mm的小切口,經切口在肝內潛行分離,形成一個 3mm×5mm大小的腔隙,將一備用的瘤塊植入其中,明膠海綿封閉肝臟切口,將肝臟回納腹腔,4號絲線逐層縫合腹壁切口各層,關閉腹腔。待實驗兔復蘇后,送回動物中心飼養。術后肌肉注射青霉素及慶大霉素(青霉素 40000U/kg,慶大霉素2000U/kg),每天 1次,共 3天,以預防感染。

1.5 影像檢查:接種后采用 CT掃描監測兔 VX2腫瘤生長情況。CT掃描包括上腹部平掃及增強雙期(動脈期及門靜脈期)掃描。于接種 VX 2腫瘤后2-3周,對實驗兔進行 DSA。插管方法:切開股動脈,采用 3FSP微導管(日本 Terumo)進行腹腔動脈和肝動脈插管。造影后采用碘化油進行肝動脈栓塞。

1.6 病理學檢查:實驗完成后處死實驗兔,進行病理學檢查。

1.7 統計學處理:采用 SPSS 12.0統計軟件對實驗數據進行統計學處理。

2 結 果

本組 26例,觀察期間荷瘤兔生長正常,無感染及其他并發癥,接種成功率 100%。腫瘤平均直徑約 8.0 mm。在 CT平掃,瘤灶呈低密度,在肝動脈期,瘤灶表現為不同程度的環形強化,在門脈期,瘤灶呈低密度,與周圍肝組織分界清楚。DSA可見腫瘤染色。肝動脈栓塞后見病灶內碘化油沉積較明顯。病理學檢查:腫瘤呈結節狀,突出于肝表面,表面較光滑,質硬,切面呈灰白色,部分瘤灶中心有灰黃色凝固性壞死,瘤灶與周圍正常肝組織分界清楚,部分可見包膜。光鏡下,腫瘤細胞呈巢狀分布,細胞較大,形態不規則,排列紊亂,血竇多,胞核大而深染,胞質量少,腫瘤組織與周圍肝組織界限清楚(圖1-10)。

3 討 論

兔 VX2肝癌接種方法較多,主要有細胞懸液經皮穿刺肝實質注射種植法,經腸系膜上動脈或門靜脈注射法,經肝動脈注射法,開腹直視下注射接種法和瘤塊包埋法等[2-4]。種植方法不同,其成功率及其表現亦不盡相同,其中以開腹瘤塊包埋法種植成功率較高。由于兔肝左葉體積明顯大于右葉,肝左動脈較粗大,肝右動脈較細小,膽囊動脈又多來源于肝右動脈,為便于操作,以及在行肝動脈栓塞時避免栓塞材料進入膽囊動脈,常將瘤組織種植在肝左葉。本實驗采用剖腹瘤塊包埋法接種兔 VX2肝癌,瘤塊多種植于肝左葉;瘤塊植入后以明膠海綿塊封閉肝切口,既避免了瘤塊逆出致腹腔種植,又具有滿意的止血效果;術中嚴格無菌操作,術后予以抗感染治療,實驗動物均無感染和出血,接種成功率 100%。

采用 CT掃描監測兔 VX2肝癌生長情況,無需開腹或處死實驗動物,病灶顯示清晰。本組兔 VX2肝癌在 CT平掃呈低密度,在動脈期呈不同程度環形強化,在門靜脈期呈較低密度[5]。在 CT圖像上,兔 VX2肝癌病灶與周圍肝組織分界清楚,與病理檢查結果一致。

關于兔 VX2肝癌的血供,文獻中尚有爭議。多數學者認為兔 VX2肝癌為富血供腫瘤[1,5-7]。Burgener等[1]對 VX2肝癌進行血管造影檢查,發現VX2肝癌血供豐富。本組兔 VX2肝癌 DSA亦顯示出腫瘤染色。但也有作者認兔 VX2肝癌血供并不豐富[8,9]。

目前,應用 CT灌注成像研究腫瘤血供已經成為影像學的熱點[10-14],但關于動物肝臟 CT灌注成像(CT perfusion imaging,CTPI)的研究報道卻較少。文獻中關于正常兔肝血流灌注的研究所測得兔肝血流灌注值的差異也較大[15-18],可能與各研究者所用方法和條件不同有關。Zhang等[19]對移植于兔大腿的 VX2瘤進行 CT灌注成像研究,結果顯示 VX2瘤的血流量(blood flow,BF)、血容量(blood volume,BV)和表面通透性(permeability surface,PS)均高于正常肌肉組織,而平均通過時間(mean transit time,MTT)低于正常肌肉組織。Kapanen等[20]采用 CT灌注成像研究 5只新西蘭大白兔 VX 2肝癌,發現兔VX2肝癌的動脈灌注量顯著高于正常肝臟的動脈灌注量,而門靜脈灌注量顯著低于正常肝臟的門靜脈灌注量。楊林等[21]采用 CT灌注成像技術對比研究 10例兔 VX2肝癌和 8例正常兔(對照組)血流灌注差異,發現兔 VX2肝癌肝動脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)和肝動脈灌注指數(hepatic arterial perfusion index,HAPI)高于對照組;門靜脈灌注量(hepatic portal perfusion,HPP)、總肝灌注量(total liver perfusion,TLP)和門靜脈灌注指數(hepatic portal perfuiosn index,HPPI)低于對照組。以上研究表明兔 VX2肝癌是主要由肝動脈供血的富血供腫瘤,與人類 PHC血流動力學特點相似,是PHC介入治療實驗研究的理想動物模型。

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