鴨腸炎病毒感染鴨外周血淋巴細胞變化研究

馬 波，李洪濤，劉峰源，張 揚，劉曉玫，烏伊罕，王君偉*

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

養鴨業已成為我國僅次于家雞馴養的第二大群體[1]，有效防治各種疫病[2]，對于我國養鴨業的健康發展尤為重要。鴨病毒腸炎（Duck viral enteritis，DVE）又名鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病在全世界范圍內流行，1923年在荷蘭首次報道，我國于1957年首次爆發，全國多省份均有流行，給養鴨業造成巨大經濟損失[3]。

由于水禽免疫系統與較為低等的爬行類動物更為接近，不同于哺乳動物及雞的免疫系統，導致目前尚未闡明DEV的感染機制及免疫機理。近年來國內學者對DEV病原及體液免疫方面的研究逐漸增多[4－6]，但關于外周血淋巴細胞在DEV感染中作用的研究相對較少。

本研究通過建立的MTS法檢測DEV對鴨外周血淋巴細胞轉化功能的影響，初步揭示了鴨外周血淋巴細胞在DEV感染期間的一個動態變化過程，對于進一步認識細胞免疫在抗DEV感染過程中的作用提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

鴨腸炎病毒弱毒疫苗（購自哈藥集團黑龍江省生物制品一廠，批號為200703）；鴨腸炎病毒AV1221標準強毒株和C－KCE疫苗毒株（均購自中國獸醫藥品監察所，由東北農業大學預防獸醫系保存）。

1.1.2 試驗動物分組及免疫

4周齡雄性非免疫金定鴨（購自哈爾濱市某養殖場），飼養至12周齡隨機分成兩組，一組3只為非免疫組（NI組），另一組6只為免疫組（IM組），兩組隔離飼養。免疫程序如下：DEV弱毒疫苗胸肌免疫，1.5個月后用 2×105TCID50DEV AV1221標準強毒株鴨胚尿囊液攻毒，于正式試驗前7 d進行弱毒疫苗加強免疫。

1.1.3 主要試劑

胰蛋白酶（購自Difco公司）；RPMI 1640（購自Gibco公司）；新生小牛血清（購自上海偉群生物技術有限公司）；PHA、CellTiter 96@AQueousNon－Radioactive Cell Proliferation Assay（G5421）（購自 Promega公司）；淋巴細胞分層液（購自中國科學院血液研究所）。

1.1.4 主要儀器

水平離心機（LD5－2A，北京醫用離心機廠）；超純水系統（Milli－Q Academic，密理博）；倒置生物顯微鏡（OLYMPUS TOKYO 210942，奧林帕斯）；自動酶標檢測儀（Model680，伯樂）；超凈工作臺（DL－CJ－2N，哈市東聯電子有限公司）；CO2恒溫細胞培養箱（REVCO RCO 3000.TVBB）。

1.2 方法

1.2.1 鴨外周血淋巴細胞轉化條件的確定

用40 g·L－1的檸檬酸鈉作為抗凝劑，足靜脈采集非免疫鴨外周血5 mL，將抗凝血輕輕疊加在盛有等體積的淋巴細胞分離液（密度1.077±0.002 g·mL－1）的試管中，1 000 r·min－1室溫水平離心 11 min，小心吸取界面細胞，用適量預熱的含100 mL·L－1FBS的RPMI 1640培養液洗細胞2次，每次1 000 r·min－1室溫下離心 11 min。細胞沉淀重懸于2 mL 1640完全營養液培養液，6 g·L－1臺盼藍拒染，活淋巴細胞計數，調整細胞濃度為1×106和2×106個·mL－1兩個濃度。將細胞加于 96 孔培養板中，每孔加200 μL細胞懸液，同時加入200 μg·mL－1的 PHA 5、10、20 μL，PHA 終濃度分別為5、10、20 μg·mL－1，每個濃度做 2 個重復，同時設置陰性對照和空白對照，37℃ 50 mL·L－1CO2分別培養48、72、96 h。培養結束后每孔吸棄100 μL培養液，不要干擾細胞，加入10 g·L－1MTS/PWS 20 μL 至終濃度為 333 μg·mL－1MTS、25 mmol·L－1PWSL，37 ℃ 50 mL·L－1CO2繼續培養 4 h，取出培養板后立即在OD490nm處利用酶標儀讀取各孔吸光值，計算刺激指數（Stimulation index，SI），確定最佳反應時間、細胞濃度和刺激物濃度。刺激指數（SI）=（試驗孔平均Dλ－空白孔平均Dλ）/（對照孔平均Dλ－空白孔平均Dλ）。

1.2.2 DEV感染鴨外周血淋巴細胞轉化條件的確定

根據上面試驗確定的細胞濃度摸索抗原特異性T淋巴細胞增殖試驗的條件。取3只免疫鴨，淋巴細胞分離及其他試驗方法同前。特異性刺激原 DEV 分別進行 10－1～10－4稀釋，每孔加2 μL，最終稀釋度為 10－3～10－6，培養 48、72、96 h后處理方法同前，確定最佳反應時間和DEV刺激濃度。

1.2.3 DEV感染鴨外周血淋巴細胞的變化

根據上面確定的最佳反應條件，對免疫組和非免疫組鴨外周血淋巴細胞進行抗原特異性T淋巴細胞增殖試驗，分別在末次免疫后第1、2、4和6周進行檢測。具體操作方法同前，設置PHA、陰性及空白對照，每個樣品做3個重復。利用SPSS 12.0分析軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 鴨外周血淋巴細胞轉化條件的確定

以PHA為刺激物，細胞濃度為2×106和1×106個·mL－1，刺激時間為24、48和72 h，計算相應刺激指數（SI），結果見表1。從表1可以看出SI最高為2.3269，此時的條件為：細胞濃度1×106個·mL－1，PHA 終濃度 5 μg·mL－1、刺激時間 72 h，因此將上述條件作為鴨外周血淋巴細胞轉化的最佳反應條件。

2.2 DEV感染鴨外周血淋巴細胞轉化條件的確定

按照已確定的細胞濃度摸索DEV最佳反應濃度和反應時間，結果見表2。

從表2可以看出，DEV在終稀釋度為10－3，培養72 h時達到最高SI，因此確定上述試驗條件為DEV最佳反應濃度和反應時間。

表1 以PHA為刺激物不同反應條件的SI值Table 1 SI in different reaction condition stimulated with PHA

表2 特異性抗原不同反應條件的SI值Table 2 SI in different reaction condition stimulated with DEV

2.3 DEV感染鴨外周血淋巴細胞的變化

DEV和PHA刺激IM組不同個體SI隨時間變化結果見表3，從表3可以看出不同個體SI隨時間變化的總體趨勢是從第1周開始逐漸升高，第4周后達到高峰，第6周回落至接近第2周的水平。其中8039、8048和8049較為典型，但總體看由于個體之間存在差異，導致SI開始上升的起點和達到高峰的時間不完全相同，如8038和8050對DEV的轉化分別是從第2周和第4周開始升高的，在第4周和第6周達到高峰。同時發現初始值較高的個體所達到的最高值較低，如8038初始值為1.225最高值為1.282，而初始值較低的個體所達到的最高值反而較高，如8039初始值為0.834，最高值為1.967。同一個體對DEV和PHA的反應表現出一致的趨勢。

DEV和PHA刺激NI組不同個體SI隨時間變化的結果見表4，從表4可以看出NI組不同個體SI隨時間并未出現較大幅度的變化，且不同個體間差異較小。除第2周SI均略高于其他3周外，第1、4和6周差異較小。第2周SI普遍較高可能是由于試驗誤差造成。同一個體對DEV和PHA的反應表現出一致的趨勢。

表3DEV、PHA刺激IM組不同個體SI隨時間變化結果Table 3 Variation of SI in IM group stimulated with DEV and PHA

表4 DEV、PHA刺激NI組不同個體SI隨時間變化結果Table 4 Variation of SI in NI group stimulated with DEV and PHA

分別將DEV和PHA刺激IM組和NI組的SI平均值進行比較，結果見表5，圖1、2。

由表5，圖1、2結果可知，IM組和NI組對DEV和PHA的刺激均表現為第1、2周IM低于NI組，第4、6周IM高于NI組，且IM組PHA變化幅度最大，由此同樣揭示出IM組不同時間SI變化明顯，出現逐漸升高而后降低的趨勢，而NI組不同時間SI基本持平。

表5DEV、PHA刺激IM組和NI組SI平均值隨時間變化結果Table 5 Comparison of SI means between immune group and non immune group stimulated with DEV and PHA

圖1 DEV刺激免疫組和非免疫組的SI平均值比較Fig.1 Comparison of SI means between IM group and NI group stimulated with DEV

3 討論與結論

圖2 PHA刺激免疫組和非免疫組的SI平均值比較Fig.2 Comparison of SI means between IM group and NI group stimulated with PHA

淋巴細胞轉化試驗是檢測抗原特異性T淋巴細胞數量的常用方法，檢測DEV抗原特異性外周血淋巴細胞轉化的MTS法尚未見報道，本研究建立了該方法并用于檢測DEV免疫鴨外周血淋巴細胞變化趨勢。

淋巴細胞轉化試驗中免疫組總體呈現的變化趨勢為逐漸升高，達到頂峰而后回落，即第1周與第2周相比略高、持平或略低，但差距不大，第4周均有不同程度的升高，第6周回落至初始水平或比初始水平略高。由此，推斷該體外變化規律也體現了整個機體對DEV進行細胞免疫應答時回憶應答的規律，表現為細胞免疫水平從末次免疫后可持續上升近4周達到高峰，4～6周開始逐漸回落。細胞免疫水平上升較為緩慢而下降卻相對較快，這可能與鴨免疫系統本身的特點有關，在鴨肝炎病毒（DHBV）表面抗原和核心抗原引起鴨細胞免疫應答動力學的研究中存在一致現象[7]。

從本試驗中還可以看出，不同試驗鴨對DEV反應的能力表現不一致，表現為反應強的個體達到高峰的時間早且強度高，而反應弱的個體達到高峰的時間晚且強度小，前者如8039、8048、8049，后者如8038和8050。分析引起上述現象的原因主要有：①不同試驗鴨個體間的確存在差異，這與鴨肝炎病毒免疫相關研究的報道一致[7－8]；② DEV可感染外周血淋巴細胞（PBL），并在此繁殖或潛伏，從而引起外周血淋巴細胞損傷，造成不同個體針對DEV的細胞免疫應答水平的起始點不同，這與其他學者研究結果一致。

岳華等先后利用不同檢測方法證明DEV無論強毒株還是弱毒株均可感染胸腺、法氏囊、脾臟、外周血等中樞或外周免疫器官，且病毒在三叉神經節及外周血淋巴細胞中可穩定存在并形成潛伏感染[4,9－11]。同時陽性對照PHA的淋巴細胞轉化結果也證明了該點，即IM組的PHA反應能力在前兩周明顯低于NI組，到第4周才高于NI組，這與李玲的研究結果一致[12]。

本研究證實MTS法可有效檢測鴨抗原特異性外周血淋巴細胞增殖情況，且鴨外周血淋巴細胞可潛伏感染DEV。

[1] 葛慶聯,章雙杰,吳華俊,等.中國地方蛋鴨品種動態保種狀態的研究[J].東北農業大學學報,2008,39(1):79－83.

[2] 肖妙,于志丹,馬波,等.減蛋綜合征病毒五鄰體重組蛋白的原核表達及抗原性鑒定[J].東北農業大學學報,2009,40(2):83－87.

[3] 黃引賢,歐守杼,鄺榮祿,等.鴨瘟病毒的研究[J].華南農學院學報,1980,1(1):21－36.

[4] 岳華,楊發龍,景波,等.鴨瘟病毒在雛鴨體內的動態定量分布及其潛伏部位研究[J].中國預防獸醫學報,2007,29(9):671－675.

[5] 齊雪峰,程安春,汪銘書,等.鴨瘟病毒抗體間接ELISA檢測試劑盒的研制[J].中國獸醫科學,2007,37(08):690－694.

[6] 袁明龍,楊永紀,諸奎龍,等.鴨瘟抗體檢測方法研究[J].中國預防獸醫學報,2001,23(2):140－143.

[7] Vickery K,Cossart Y,Gu X,et al.Antigen－specific blastogenesis assays for duck hepatitis B virus using duck peripheral blood and splenic mononuclear cells[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1997,59:349－358.

[8] Vickery K,Cossart Y,Dixon R.Comparison of the kinetics of the specific cellular immune response to duck hepatitis B virus in infected and immune ducks[J].Veterinary Microbiology,1999,68:157－169.

[9] Proctor S J.Pathogenesis of duck plague in the bursa of fabricius,thymus and spleen[J].American Journal of Veterinary Research,1976,37:427－431.

[10]Shawky S.Target cells for duck enteritis virus in lymphoid organs[J].Avian Pathology,2000,29(6):609－616.

[11]程安春,汪銘書,劉菲,等.PCR在鴨瘟臨床診斷和免疫及致病機理研究中的初步應用[J].病毒學報,2004,20(4):364－369.

[12]李玲,朱堃 熹,林在堯.淋巴細胞轉化試驗在鴨體上的應用II鴨瘟病毒對鴨外周血淋巴細胞轉化能力的影響[J].江蘇農學院學報,1988,9(2):5－8.