復方中草藥對鏡鯉（Cyprinus carpio L.）血清轉氨酶及紅細胞抗氧化酶活性的影響

孟兆娜，陳玉春，管雪婷，張 輝，劉 敏*

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

隨著水產養殖業集約化程度的不斷提高，大量化學及抗生素類藥物被長期使用，不但造成環境和水質污染，而且致使病原體的抗藥性和水產品的藥殘、藥害等毒副作用日益增強，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失。中草藥具有成本低、加工方便、抗藥性小且藥物殘留少、效果顯著等特點，已逐步成為水產動物飼料添加劑研究的熱點[1]。其中，部分中草藥成分已作為免疫增強劑得到廣泛應用，同時還是良好的抗菌、抗病毒的治療藥物[2]。研究表明，中草藥可以有效提高淡水蝦、中國對蝦、異育銀鯽和牙鲆的免疫力[3－7]。蔡中華等研究報道，黃連、大黃及花粉對鯉魚的非特異性免疫功能具有增強作用[8]。陳玉春等研究了中草藥作為飼料添加劑對鯉魚血清轉氨酶的影響，發現對鯉血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶的活性有一定的降低誘導作用[9]。蔡春芳等研究發現，大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪能夠顯著促進銀鯽血清中溶菌酶、超氧化物岐化酶的活性[10]。

目前，復方中草藥作為免疫調節劑對鏡鯉免疫學的研究在國內鮮有報道，本試驗通過金銀花、刺五加、枸杞子、黃芪配伍的四組復方中草藥研究對鏡鯉血清轉氨酶及紅細胞中過氧化氫酶、超氧化物岐化酶活性的影響，為復方中草藥作為魚類免疫增強劑的應用研究提供一定的理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

金銀花、刺五加、枸杞子、黃芪（均購自哈爾濱市寶豐藥店），經烘干、粉碎后按一定比例進行組方，制成四種復方（復方Ⅰ、復方Ⅱ、復方Ⅲ、復方Ⅳ）。基礎日糧以國產魚粉17%、豆粕47%、麩皮23%、面粉10%、食鹽0.6%、磷酸二氫鈣1.2%、預混料1.2%為原料進行配制。每復方稱取原料20 g，置于砂鍋中并加入200 mL蒸餾水，煎煮3次，每次30 min，合并3次濾液添加到1 kg的基礎日糧中并混勻，制成含2%復方水提液的藥物飼料結果見表1。

表1 復方中草藥配方比例Table 1 Formula proportional of Chinese herb compounds (%)

1.2 試驗動物

試驗用鏡鯉（Cyprinus carpio L.）購自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所松浦實驗站。試驗前，投喂不含中藥添加劑的飼料（基礎日糧）對實驗魚進行馴化，使其逐漸適應實驗飼料。經過14 d的馴化飼養后，選擇體型均勻、初始體重為（160±15）g的實驗魚，將實驗魚分為5個處理，每個處理2個重復，每個重復18尾，試驗周期為42 d。各處理組依次為對照組（基礎日糧組）、復方Ⅰ、復方Ⅱ、復方Ⅲ、復方Ⅳ。實驗魚飼養于室內玻璃水族箱（0.9 m×0.5 m×0.5 m），體積為 180 L。以充分曝氣的自來水作為循環水源。水溫控制在23±1 ℃，pH 7.6～8.0。溶解氧＞8 mg·L－1。日投喂量為魚體重的1.5%，早、中、晚各投喂（分別為8:30、12:30、17:00）1次，3 d換水1次，6 d消毒1次。

1.3 樣品收集與測定

試驗過程中，分別于14、28、42 d從各試驗組中隨機取3尾魚于尾靜脈取血4.5 mL，將其中0.5 mL血液經肝素鈉抗凝備用；剩余4 mL血液靜置 2 h，以 1 000 r·min－1離心 10 min，得到血清樣品，置－20℃冰箱保存備用。

取50 μL抗凝血加雙蒸水至2.5 mL混勻配成1：49的溶血液，進行紅細胞CAT活性的測定；取抗凝血 50 μL，加入2 mL生理鹽水，以 2 000 r·min－1轉速離心3 min，去上清并加入冰雙蒸水0.2 mL混勻，隨后加入95%乙醇0.1 mL振蕩30 s，并加入三氯甲烷0.1 mL置旋渦混勻器混勻1 min，以3 500 r·min－1離心8 min，吸取上清液并記錄其體積，進行紅細胞SOD活性的測定。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定血清中GOT、GPT的活性及紅細胞中CAT、SOD的活性。

1.4 數據分析

采用SPSS 13.0對所得數據進行單因素方差分析（One－way ANOVA），若有顯著差異，再作LSD多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 血清GOT、GPT活性的變化

四種復方中草藥對鏡鯉血清GOT、GPT活性的影響見表2。

表2 鏡鯉血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

表2 鏡鯉血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

注：同列相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），同列不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），未標注差異不極顯著。下表同。Notes:values in the same column with the same little letters are no significant difference(P＞0.05),with different little letters are significantly differentce(P＜0.05),values in the same column with different capital letters are extremely significant difference(P＜0.01).The same as below.

時間（d）Time組別Group谷丙轉氨酶（IU·L－1）Glutamic－pyruvic transaminase 24.38±9.20 22.96±5.37 14谷草轉氨酶（IU·L－1）Glutamic－oxal(o)acetic transaminase 44.58±8.77 41.55±11.63 37.37±6.5520.46±8.86 40.15±10.19 25.60±7.28 39.63±5.22 23.70±8.20 43.86±12.32b 19.35±4.82b 38.22±8.48ab 18.47±6.41ab 2833.30±5.01a 14.35±2.74ab 37.06±7.21ab 13.54±2.67a 42.64±12.77b 15.63±3.94ab 40.73±11.88 20.62±2.14Bc 37.78±13.31 12.14±5.08Aab 42對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ32.49±4.87 7.62±1.85Aa 36.77±7.73 14.13±9.21Ab 36.80±8.5413.89±6.73Ab

從表2可以看出，14 d時，血清GOT活性各復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時，復方Ⅱ組與對照組差異顯著（P＜0.05），復方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；42 d時，各復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。14 d時，血清GPT活性各復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時，僅復方Ⅲ組與對照組差異顯著（P＜0.05），復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；42 d時，各復方組與對照組差異極顯著（P＜0.01），但各復方組之間差異不顯著（P＞0.05）。試驗周期內4個復方組均有效地降低了血清中GOT及GPT的活性，且隨中草藥飼喂時間的增加，GOT及GPT的下降幅度也隨之增加，GPT活性的下降幅度比GOT大，表明4組復方在該試驗周期內對魚體肝臟起到了一定程度的保護作用。

2.2 紅細胞CAT、SOD活性的變化

四種復方中草藥對鏡鯉紅細胞CAT、SOD活性的影響見表3。從表3可以看出，14 d時，各復方組紅細胞CAT活性與對照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時，僅復方Ⅰ組與對照組差異顯著（P＜0.05），雖然其他復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05），但是其紅細胞CAT活性明顯高于對照組，說明此期間各復方誘導CAT活性升高。42 d時，僅復方Ⅰ組與對照組差異顯著（P＜0.05），但是各復方組CAT活性均呈現下降的趨勢。14 d時，紅細胞SOD活性各復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05）；28 d時各復方組與對照組差異極顯著（P＜0.01），各復方組SOD酶活性均保持在較高水平；42 d時，各復方組與對照組差異不顯著（P＞0.05），雖然開始呈下降趨勢，但仍明顯高于對照組。

表3 鏡鯉紅細胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

表3 鏡鯉紅細胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

時間（d）Time組別Group對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ對照復方Ⅰ復方Ⅱ復方Ⅲ復方Ⅳ過氧化氫酶（U·g－1Hb）Catalase 32.71±4.57 40.10±11.91超氧化物歧化酶（U·g－1Hb）Superoxide dismutase 386.52±102.35 487.96±304.36 1437.18±8.14461.56±119.07 37.28±10.67 497.25±215.42 35.42±8.06 559.41±279.01 33.51±6.65a 528.79±92.27Aa 43.42±10.80b 1 326.41±324.01Bc 2838.52±9.27ab 936.17±227.47Bb 39.90±11.48ab 1 155.20±427.64Bbc 35.63±6.83ab 1 023.45±153.15Bb 30.00±4.70a 335.12±160.86 39.58±7.23b 514.46±207.46 4233.17±11.28ab 436.33±168.33 35.37±6.72ab 410.19±171.59 32.82±9.51ab 373.10±304.68

3 討論與結論

3.1 復方中草藥對血清轉氨酶活性的影響

GPT和GOT是廣泛存在于動物線粒體中的重要的氨基酸轉氨酶，在機體蛋白質代謝中起重要作用[11]，其活性變化亦是反映肝細胞受損傷的主要敏感指標。在正常情況下，血清中正常轉氨酶活性值較小；當組織中毒發生病變或者受損傷的組織范圍較大，可引起血清中GPT和GOT濃度上升或活性突然持續性增強[12]。血清轉氨酶升高反映肝細胞受損，其增高程度大致與病變嚴重程度相平行[13]。因此血清中GOT和GPT活性的增減可以反映機體中毒或病理變化。陳鵬飛等通過兩種中草藥組方對鯽魚轉氨酶影響研究發現中草藥對魚體有保肝的功效[14]，即可以有效地的使血清中的GOT、GPT降低，且隨添加濃度的升高，魚體血清中GPT和GOT的下降幅度也隨之增大。田海軍、楊加瓊等同樣得出類似結論[15－16]。在本試驗中，14 d時僅復方Ⅰ肝臟GOT活性與對照組差異顯著（P＜0.05），其余各復方組肝臟GOT、GPT活性與對照組差異均不顯著（P＞0.05）；28 d時，復方Ⅱ組血清GOT活性和復方Ⅲ組血清GPT活性極顯著與對照組差異顯著（P＜0.05）；42 d時，各復方組血清GPT活性與對照組差異極顯著（P＜0.01）。隨中草藥飼喂時間的增加，GOT、GPT活性下降幅度也隨之增大。結果表明，本試驗4組復方在42 d內未對肝臟造成損傷，還在一定程度上起了保護作用，其中復方Ⅰ組轉氨酶活性值降低幅度最小。

3.2 復方中草藥對紅細胞CAT活性的影響

過氧化氫酶（CAT）又稱觸酶，是生物體內重要的抗氧化防御性功能酶，體內SOD清除過量O2－所產生的過量H2O2可由CAT與谷胱甘肽過氧化物酶等一起消除，從而維持機體正常的機能[17－18]。CAT酶廣泛存在于魚體的各個器官中，是評價污染物對水生生物影響的重要指標[19]。大量試驗表明，在污染脅迫下生物體可通過增強CAT清除活性氧的水平以減輕對機體的傷害，其活性可因氧化污染的脅迫而發生改變[20－22]，因此CAT的活力變化在一定程度上能反映出機體在脅迫環境下的抗氧化系統的變化。試驗表明，14 d時復方Ⅰ誘導CAT的活性使其升高，降低了中草藥對組織細胞氧化損傷作用，有效的防御組織的過氧化損傷，隨著試驗時間的延長這種作用表現為降低。28 d時，雖然僅復方Ⅰ組紅細胞CAT活性與對照組差異顯著（P＜0.05），但其余各復方也均誘導CAT活性升高；42 d時，復方Ⅰ與對照組差異極顯著（P＜0.01），但各組CAT活性均呈現下降趨勢。試驗初期，機體為清除過多的H2O2，通過自身調節而使CAT的合成量升高，但隨著試驗時間的延長，機體產生了大量的活性氧中間體，超過了機體清除活性氧的能力，使大量活性氧中間體作用于酶蛋白分子的關鍵性氨基酸殘基，使CAT上的－SH巰基氧化成SOS，從而改變CAT酶的結構，使CAT活性降低[23]，對機體抗氧化系統產生了不同程度的傷害。由表3可得，復方Ⅰ組中CAT值升高最明顯，紅細胞CAT活性受復方Ⅰ的影響最大。

3.3 復方中草藥對紅細胞SOD活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是反映機體非特異性免疫功能的重要生理指標。它是一種堿性蛋白，能水解革蘭氏陽性細胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解后被釋放出來，形成一個水解酶體系，破壞和消除侵入體內的異物。其活性變化可反映機體清除自由基的能力，對于增強吞噬細胞防御能力和整個機體的免疫功能具有重要作用[24]，因而SOD經常被用作環境脅迫與水域污染的潛在指標。SOD是清除活性氧免受細胞氧化傷害的主要抗氧化酶類之一，在防御機體衰老和生物分子損傷等方面有極為重要的作用[18]，它催化超氧陰離子自由基O2－發生歧化反應，從而清除O2－，減少超氧陰離子在生物體內的積聚并阻斷其轉化為自由基，維持細胞內的氧自由基處于低量無害狀態[25－26]。直至1969年McCord和Fridovich研究了該蛋白的活性以后[27]，才根據其酶活特性定名為超氧化物歧化酶。本試驗表明：14 d時，各復方組與對照組差異均不顯著（P＞0.05）；28 d時，各復方組與對照組差異極顯著（P＜0.01），各復方組SOD活性均保持在較高水平，雖然在第42天開始呈下降趨勢，但仍明顯高于對照組。證明本試驗的四個復方對鏡鯉紅細胞的SOD活性有一定的誘導作用，并且復方Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ組SOD活性均表現為“先增高再降低”，復方Ⅱ組的SOD活性隨著作用時間的增加也逐漸被誘導增高。原因可能是各復方在處理初期對紅細胞SOD活性有誘導作用，這種誘導作用是由活性氧自由基的增加所引起的機體代償性增多所致。這和樊甄姣報道的氨氮濃度引起SOD活性暫時升高相一致。隨著藥物作用的時間延長[28]，魚體內O2－對羥胺的氧化反應被抑制，使O2－含量升高，消耗大量的SOD，導致SOD水平的降低。機體在清除大量自由基的過程中，ATP生成減少，細胞內能量不足，使SOD合成發生障礙、活性下降，使機體清除自由基的能力下降[29]，堆積的自由基一方面可直接作用于細胞，產生細胞結構和功能的損害，另一方面可致微循環發生變化，使細胞缺血缺氧，產生代謝障礙，進一步加劇機體損害[30]，從而導致魚體的免疫能力、抗應激能力和抗病能力的下降。SOD作為抗氧化劑的作用隨著藥物作用時間延長而逐漸減弱，從而造成魚體的過氧化脅迫，進而有產生毒性作用的趨勢，建議用藥時間為28 d。

本試驗得出，本復方中草藥可以按質量分數為2%的量加到鏡鯉飼料中，以增強其血清轉氨酶及紅細胞抗氧化酶的活性，進而增強其抗病力，其中復方Ⅰ效果最佳，建議用藥時間為28 d。

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