巴西蘑菇液體培養及胞外多糖積累研究

鄭樹生，梁麗琨，倪新江

（1.黑龍江八一農墾大學測試中心，黑龍江 大慶 163319；2.山東煙臺大學生物理工學院，山東 煙臺 264005）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murvill）原產于北美南部和南美北部等地，具有濃郁的杏仁香味，含有豐富的蛋白質和氨基酸，特別是促進兒童生長發育和增加智力的精氨酸和賴氨酸，氨基酸總量占干重的21.37%，必須氨基酸占氨基酸總量39.7%，此外還含有多糖、甾類等生理活性物質，是一種食藥兼用的珍稀食用菌，其多糖含量位于食用菌之首。巴西蘑菇多糖具有抑制腫瘤、降低血脂、抗癌、抗凝血等功效，可提高肌體免疫力，預防心腦血管疾病。日本三重大學醫學部岡本丈博士對巴西蘑菇多糖的抗癌性進行詳細研究，結果表明，巴西蘑菇多糖對移植到小鼠體內的多形細胞肉瘤細胞的全治率（生存率）和阻止率是最高的，達90%，而靈芝最低，僅20%。該結論得到東京大學醫學部、日本國立癌癥中心研究所、東京藥科大學證實[1]。

由于巴西蘑菇的栽培條件要求較苛刻，而且國內對其栽培研究起步較晚，作為商品進行生產和銷售的很少，因此價格較高。研究表明巴西蘑菇液體培養菌絲體的蛋白質、多糖等成分的含量與子實體相當，但生產周期卻大大縮短，有利于巴西蘑菇功能食品及抗癌藥物的生產。本試驗選用了成本低、來源廣的天然材料作為液體培養基原料，研究了不同培養基中巴西蘑菇菌絲體和胞外多糖的積累，得到了適合巴西蘑菇菌絲生長并積累豐富胞外多糖的液體培養基配方，為更好的開發和利用巴西蘑菇資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

巴西蘑菇1號菌種，本實驗室保藏。

1.2 培養基

基礎液體培養基：葡萄糖3%、蛋白胨2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB 110 mg·100 mL－1。

母種培養基：金針菇菌糠（煮汁）20%、葡萄糖2.0%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.01%、瓊脂2%。

供試碳源：發酵棉籽殼、馬鈴薯、蔗糖、小麥粉、玉米粉、地瓜粉。

供試氮源：麩皮、黃豆粉、硫酸銨、尿素。供試生長因子：巴西蘑菇菌糠煮汁、酵母粉。有機天然碳（碳源添加0.1%的α－淀粉酶）、氮源均煮1 h，過濾備用。

1.3 培養方法

取活化菌種3～4塊接種于母種培養基平板上，25～28℃培養3～5 d，無菌打孔器打孔，切取尖端菌絲，用接種鏟將菌種薄片接種于含50 mL液體培養基的300 mL三角瓶中，每瓶3塊，使菌種塊漂浮于液體表面，25～28℃靜止培養48 h，待菌絲萌發后，25～28 ℃，130 r·min－1，搖床培養 7 d。

1.4 生物量的測定

1.4.1 菌絲球計數

將發酵液倒人培養皿中攤勻，取出菌種塊，培養皿下墊方格紙，方格法計數。

1.4.2 菌絲干重測定

溝通了上面的意思，我說：“這樣的問題，你不用解釋，也沒辦法解釋。任何解釋都會使問題變得更加麻煩。只要你態度明確毫不含糊地說‘不’，就是對她對你最好的負責任的表現，相信女孩會很快地調整好自己的情緒。當然，如果‘是’，就另當別論了。”

紗布過濾得菌絲球，并用蒸餾水洗滌3次，60℃烘至恒重。

1.5 胞外多糖的提取與測定

1.5.1 胞外多糖的提取

發酵液 4 000 r·min－1離心 15 min，去沉淀，加入3倍體積95%乙醇，0～4℃冰箱醇析24 h，離心棄上清液，95%乙醇洗滌2次，加入10倍體積的蒸餾水，80℃水浴溶解，4 000 r·min－1離心15 min，去沉淀，得多糖上清液。

1.5.2 Sevag法除蛋白

在多糖水溶液中加入等體積的Sevag試劑（正丁醇：四氯化碳=4：1），于125 mL分液漏斗中，振蕩后靜置分層，取下層液體，重復1～2次，直至上層有機相澄清為止。

1.5.3 多糖的測定

處理后的多糖溶液，100 mL容量瓶定容，用苯酚硫酸法測定多糖含量[2]。

2 結果與分析

2.1 最佳液體培養時間確定

圖1 姬松茸液體培養菌絲體生長曲線Fig.1 Growth curve of mycelium in submerged culture of Agaricus blazei

2.2 不同碳源對菌絲生物量和胞外多糖產量的影響

分別用葡萄糖、發酵棉籽殼、蔗糖、玉米粉、小麥粉、地瓜粉、馬鈴薯替代基礎液體培養基中的葡萄糖，25～28℃搖床培養7 d，測定生物量和胞外多糖含量，結果見表1。巴西蘑菇菌絲在不同碳源中的生長速度不同，葡萄糖和玉米粉為碳源時菌絲生長情況明顯好于其它碳源，玉米粉培養基中產生的小菌絲球（D＜1 mm）占絕大多數，菌絲球個數最多，可達655個·50 mL－1，菌絲干重和胞外多糖最高，為 0.952 g·50 mL－1和 72.595 mg·50 mL－1。其次是葡萄糖中產生的總菌絲球個數、菌絲干重和胞外多糖含量分別為 578 個·50 mL－1、0.725 g·50 mL－1和61.328 mg·50 mL－1，說明在這些培養基中接種后萌發點多，生長速度快，因此葡萄糖和玉米粉均是巴西蘑菇液體培養的優良碳源。

2.3 不同氮源對巴西蘑菇生物量和胞外多糖的影響

將基礎培養基中的氮源分別更換為麩皮、黃豆粉、尿素和硫酸銨，搖床培養7 d，測定生物量和胞外多糖，結果見表2。巴西蘑菇菌絲在以麩皮和硫酸銨為氮源的培養基中菌絲生物量大，胞外多糖含量高，分別為 0.805 g·50 mL－1、89.933 mg·50 mL－1、0.768 g·50 mL－1和 94.825 mg·50 mL－1，說明硫酸銨和麩皮都是巴西蘑菇液體培養的良好氮源。

表1 不同碳源對巴西蘑菇生物量和胞外多糖含量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

表2 不同氮源和生長因子對巴西蘑菇生物量和胞外多糖產量的影響Table 2 Effect of different carbon sources and growth factors on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

2.4 不同生長因子對菌絲生物量和胞外多糖含量的影響

在基礎培養基中分別添加10%的巴西蘑菇菌糠汁和0.5%的酵母粉，搖床培養7 d，測定生物量和胞外多糖，結果見表2。巴西蘑菇菌絲體在添加巴西蘑菇菌糠汁的培養基中生長狀況明顯好于對照，表現在生物量明顯增加，胞外多糖含量顯著提高，生物量和胞外多糖分別達1.007 g·50 mL－1和127.734 mg·50 mL－1，可見栽培過巴西蘑菇的菌糠廢料是其液體培養時優良的生長促進劑，而酵母粉對菌絲液體培養沒有明顯促進作用。

2.5 培養基綜合試驗

根據經驗和報道，姬松茸液體培養中采用復合培養基菌絲體生長狀況好于簡單培養基，綜合上述試驗結果，選用2%玉米粉和2%葡萄糖作碳源，以1%麩皮和1%硫酸銨作氮源，添加10%的巴西蘑菇菌糠汁，設計綜合培養基，搖床培養7 d，測定生物量和胞外多糖，結果見表2。綜合培養基的生物量顯著增加，直徑＜1 mm的菌絲球占絕大多數，總數達1 498個·50 mL－1，菌絲體干重1.226 g·50 mL－1，胞外多糖積累量 189.428 mg·50 mL－1，證實復合碳、氮源更有利于姬松茸菌絲體生長和胞外多糖積累。

2.6 正交試驗篩選最佳培養基配方

選擇玉米粉＋葡萄糖/麩皮＋硫酸銨、巴西蘑菇菌糠汁及KH2PO4＋MgSO4·7H2O四因素，采用L9（34）正交表進行四因素三水平正交試驗（培養基中均含VB110 mg·50 mL－1），因素水平表見表3。正交試驗結果見表4。各因素的最優水平組合是A3B3C2D1，即玉米粉2%、葡萄糖1%、麩皮2%、硫酸銨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。

表3 試驗因子水平Table 3 Level of experimental factor (%)

表4 正交試驗結果Table 4 Result of orthogonal experiment

對胞外多糖產量的影響因素進行直觀分析，A因素極差R值為246.4，明顯大于B、C、D三因素，說明A因素對胞外多糖產量影響最大，即玉米粉和葡萄糖濃度和配比對巴西蘑菇胞外多糖產量起主要作用，各因素的主次順序為：A＞C＞B＞D。

對正交試驗胞外多糖產量進行方差分析，結果見表5。A因素即玉米粉和葡萄糖濃度及配比對胞外多糖產量有極顯著的影響，而麩皮和硫酸銨濃度及姬松茸菌糠汁對胞外多糖產生有非常顯著的影響，KH2PO4和MgSO4·7H2O則影響不顯著。

表5 正交試驗胞外多糖產量方差分析結果Table 5 Result of exopolysaccharide output variance analysis in orthogonal experiment

3 討論與結論

3.1 巴西蘑菇液體發酵的最適培養基

為適合工業生產，試驗中采用了價格低、來源廣的有機碳、氮源作為材料，對巴西蘑菇液體培養基的配方進行篩選，得到巴西蘑菇液體發酵的最適培養基的配方為玉米粉2%、葡萄糖1%、麩皮2%、硫酸銨 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。玉米粉和葡萄糖、麩皮和硫酸銨分別是巴西蘑菇液體培養的優良碳、氮源。玉米粉在食用菌液體培養中的作用在其他報道中已被證實[3]，由于玉米粉溶液粘度較大，增加了培養液的粘性拉力，菌絲間易被發酵液機械性地拉開，從而使菌絲球小型化。在食用菌液體培養液中一般認為應有大量的菌絲球，這樣生長中心多，生物量大，而且菌絲球的大小應在1 mm左右，這樣菌絲球內部不會產生氧和營養饑餓的情況，使菌絲生長受到抑制[4]。培養基中添加巴西蘑菇菌糠煮汁不僅明顯促進了巴西蘑菇菌絲體生長和胞外多糖積累，而且產生了大量的小菌絲球，可能由于巴西蘑菇菌糠中存在有利于巴西蘑菇菌絲生長的多種營養因子。很多報道中使用的酵母粉的效果遠不如巴西蘑菇菌糠煮汁。天然原料如玉米粉、麩皮優于葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、尿素等簡單原料，兩種類型的原料配合使用效果更佳。

3.2 巴西蘑菇液體發酵胞外多糖含量的變化

在巴西蘑菇發酵液中，有一定含量的胞外多糖，由于真菌的多糖大部分存在于細胞內部，在一定條件下才有一部分分泌到細胞外。因此，液體培養基中胞外多糖含量與菌絲生物量不成正相關。培養基加入巴西蘑菇菌糠煮汁，不僅對菌絲球生長有利而且有利于胞外多糖的分泌，但菌糠汁中有巴西蘑菇菌絲體的胞內多糖，因此，在測定發酵液中胞外多糖時需減去50 mL 10%的巴西蘑菇菌糠煮汁所含的多糖量。

3.3 巴西蘑菇菌糠對菌絲體生長的促進作用

栽培食用菌后的菌糠的應用價值值得重視，倪新江等認為食用菌栽培結束后，菌糠中的含氮量大幅度升高[5]。不同的食用菌菌糠在其他的食用菌栽培中往往有重要的利用價值。本試驗證實了巴西蘑菇菌糠對這種食用菌液體培養菌絲體生長的促進作用，在巴西蘑菇母種培養基中使用的金針菇菌糠對菌絲體生長也有促進作用。

3.4 巴西蘑菇液體發酵菌絲體生長的變化

據報道食用菌液體培養需先靜止培養1～2 d[6-8]，試驗中也發現，如果不靜止培養，則巴西蘑菇菌絲體在液體培養基中萌發較慢。在接種時應注意使接種塊的菌絲面向上，漂浮于液體的表面，待菌絲體萌發后再上搖床。在靜止培養時，添加巴西蘑菇菌糠的培養基菌種塊萌發較快，菌絲濃密，經過48 h，菌絲可長達3 mm，而其他培養基的菌絲一般短而疏[9-10]。

食用菌的深層發酵技術越來越受到人們的重視，因為在液體深層培養過程中，菌絲細胞能在最適的溫度、pH、氧氣和C/N等條件下生長，呼吸作用產生的代謝廢氣能及時排出，新陳代謝旺盛，菌絲生長迅速，在短期內就能獲得大量的菌絲體，適合大規模工業生產的要求。發酵液經醇析去蛋白可得到胞外多糖，用菌絲體代替子實體可制備菌絲體多糖，這不僅在醫藥、保健工業中有很高的應用價值，而且在食品、飼料等工業上也有廣闊的前景。

[1] 陳智毅,李清兵,吳娛明,等.巴西蘑菇的食療價值[J].中國食用菌,2001,20(4):4-6.

[2] 張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].上海:上?？茖W技術出版社,1987.

[3] 楊梅,林琳,張其昌.姬松茸菌絲深層培養及氨基酸分析研究[J].中國食用菌,1997,16(3):41-43.

[4] 張甫安,陳國榮,李偉芳,等.菌菇深層發酵和液體菌種生產[J].中國科學文化,2001,45(2):66-69.

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[6] 凌建亞,李灝,張長鎧.濃香乳菇深層發酵工藝的研究[J].食品與發酵工業,2000,26(4):3-5.

[7] 李瀅冰,馮夢醒,徐繼祖.海藻糖在灰樹花深層發酵中的積累及多糖的提取[J].食品與發酵工業,2000,26(2):11-15.

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