清熱養(yǎng)心顆粒提取工藝研究

陳春鶯，劉志輝，錢 芳，陸 超

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

清熱養(yǎng)心顆粒由金銀花、黃連、酒黃精、百合等組成，具有清熱解毒、養(yǎng)心安神之功效，臨床用于治療熱毒侵心、氣陰兩傷、心神失寧的病毒性心肌炎急性期以及合并心律失常、心悸胸悶者。本研究通過正交試驗(yàn)確定其最佳提取工藝，報道如下。

1 儀器與試藥

Waters515型高效液相色譜儀，Waters2487型紫外檢測器；ZW色譜柱恒溫箱（中科院大連化學(xué)物理研究所）；Empower色譜工作站；手動進(jìn)樣器，20!L定量環(huán)；BP-211D型1/10萬電子分析天平（德國Sartorius）；KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（南通滬通制藥機(jī)械設(shè)備廠）；HH-4數(shù)顯型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。綠原酸對照品（含量測定用，批號為0753-9910，購自中國藥品生物制品檢定所）；高效液相色譜所用試劑為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純；所用中藥材均購自江蘇省藥材公司，并由本室專家鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)因素水平選擇

取處方量藥材，選用正交試驗(yàn)表L9（34），3因素分別為加水量（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數(shù)（因素C），因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2 水提取得率

精密吸取各樣品溶液3 mL，水浴蒸干，置105℃烘箱中干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min，取出，迅速稱重。

2.3 正丁醇萃取得率

精密吸取各樣品溶液30mL，加水飽和的正丁醇萃取3次，每次20mL，合并萃取液，水浴蒸干，置105℃烘箱中干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min，取出，迅速稱重。

2.4 綠原酸含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：SupelcoODS柱（250mm×4.6mm，5!m）；流動相[1]：乙腈-0.2％磷酸溶液（10∶90）；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20!L。

2.4.2 溶液制備

精密稱取綠原酸對照品15.05mg，置棕色量瓶中，加50％甲醇溶解制成每mL含綠原酸301!g的對照品貯備液，用50％甲醇稀釋至30.1，15.05，7.525，3.762 5，1.881 3，0.940 6!g/mL質(zhì)量濃度的對照品溶液。分別吸取相當(dāng)于金銀花藥材0.05 g的正交試驗(yàn)提取液，置50mL容量瓶中加50％甲醇至刻度，用微孔濾膜（0.45!m）濾過，濾液作為供試品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的對照品溶液各20!L，注入高效液相色譜儀中測定。經(jīng)線性回歸，得綠原酸回歸方程Y=67 848X-29 318，r=0.999 7。結(jié)果表明綠原酸質(zhì)量濃度在0.940 6～30.1!g/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液20!L，注入高效液相色譜儀，重復(fù)測定5次，以峰面積計算，RSD為1.99％。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批次6份樣品，進(jìn)行平行試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為1.85％。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按上述色譜條件，于0，2，4，6，8，12h分別進(jìn)樣，測定色譜峰面積。結(jié)果 RSD為2.15％（n=6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批次6個樣品，分別加入綠原酸對照品，測得平均回收率為97.83％，RSD為1.04％（n=6）。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，分別測定提取液中綠原酸量、正丁醇萃取得率和水提浸膏得率。綠原酸量為水煎提取正交試驗(yàn)的主要考核指標(biāo)，同時將正丁醇萃取得率和水提浸膏得率作為水煎提取正交試驗(yàn)的考核指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別定為0.7，0.2，0.1。把綠原酸量 Y1（g）、正丁醇萃取得率 Y2（％）、水提浸膏得率Y3（％）最高者定為100，其余按公式Y(jié)′1= Y1i/Y1max×100，Y′2=Y2i/Y2max×100，Y′3=Y3i/Y3max×100，計算相應(yīng)得分，再按公式Y(jié)=0.7Y′1+0.2Y′2+0.1Y′3計算綜合評分作為篩選指標(biāo)。結(jié)果見表2。

表2 水煎提取正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 方差分析

方差分析表見表3。由方差分析表和正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，因素A對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素B、因素C對試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響。因素A相對其他因素影響較大，各因素影響大小次序?yàn)锳＞B＞C；各因素不同水平的影響大小次序?yàn)锳3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。因此最佳提取工藝為A3B3C3，即每次加水10倍，每次煎煮60min，煎煮3次。考慮到工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際和節(jié)能，優(yōu)選工藝為A2B3C3，即每次加水10倍，每次煎煮60min，煎煮2次。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取與正交試驗(yàn)等量藥材3份，按優(yōu)選的提取工藝提取，測定各指標(biāo)成分含量。結(jié)果平均浸膏得率為33.12％，平均正丁醇萃取得率為3.77％，綠原酸平均含量為114.29mg，所測得平均綠原酸含量、平均浸膏得率和正丁醇萃取得率接近正交最高量，故優(yōu)選的工藝可行。

表3 方差分析表

3 討論

參考2005年版《中國藥典（一部）》金銀花藥材項(xiàng)下方法[1]，分別以不同比例的乙腈-0.2％磷酸溶液為流動相，結(jié)果乙腈-0.2％磷酸溶液（10∶90）能獲得滿意的分離。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，因素A對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素B、C對試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響。因素A中A1、A2差異較大，A2、A3差異較小，故優(yōu)選A2為最佳提取工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選工藝合理可行。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：153.