利膽排毒口服液對大鼠膽汁及尿液中內毒素含量的影響

常明向 吳梅梅 劉浩

近20年來，內毒素的研究已成為醫學科學研究中最為活躍的領域之一。內毒素存在于革蘭氏陰性菌胞壁外膜，在細菌死亡、裂解后釋放出來，大量內毒素進入血循環系統則產生內毒素血癥。在化療藥物十分發達的今日，內毒素血癥仍是革蘭氏陰性細菌敗血癥死亡率達50%左右的主要原因，還是許多危急難治性疾病如急性肺衰、腎衰、肝衰、急性彌散性血管內凝血等的主要病因。內毒素血癥可造成廣泛的病理反應，如多器官功能不全綜合征、彌散性血管內凝血、多臟器功能衰竭及休克等,是一種現代復雜難治性疾病。

根據最新國內外研究成果，結合傳統中醫理論，在茵陳蒿湯與調胃承氣湯合方的基礎上進行加減，研制出了一個新復方制劑——利膽排毒口服液。該方具有保肝利膽、通俯排毒、益氣活血、清熱解毒的功效，用于治療內毒素血癥。研究表明，該制劑對內毒素血癥小鼠保護率達100%。為進一步研究該制劑對內毒素的體內滅活作用，本課題研究了其對大鼠膽汁流量的影響，對大鼠膽汁及尿液中內毒素含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

自制利膽排毒口服液(含茵陳、梔子、大黃、甘草、芒硝等藥味), 每毫升含生藥量1 g。內毒素(LPS， E.ColiO111B4， 5 mg/支，購自Sigma)，臨用前用生理鹽水配成1 mg/ml的溶液。無熱原試管，潔凈試管使用前在馬輻式爐中經250℃高溫烘烤3小時。無熱原槍頭(購自北京金山川公司)。內毒素測定試劑盒(上海伊華公司)。

1.2 動物

Wister大鼠，體重180～200 g ,雄性(購自中科院武漢實驗動物中心)。實驗前15小時禁食不禁水。

1.3 膽汁收集與流量測定

取雄性大白鼠8只, 每鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥進行麻醉, 然后仰位固定于大白鼠解剖臺上,再沿腹中線切口, 打開腹腔, 翻轉十二指腸, 找到膽管, 在膽管下穿線, 結扎乳頭部, 向肝臟方向作“V”形切口, 插入塑料管, 可見有淡黃色膽汁流出, 結扎固定, 待膽汁流出穩定后, 觀察藥前20分鐘內膽汁流出的總滴數作為對照, 再向十二指腸管內注射利膽排毒口服液1 ml/100 g體重, 從給藥后20分鐘開始觀察紀錄第20～40分鐘, 40～60分鐘內膽汁流出的總滴數, 與用藥前比較, 兩組數據間的比較用t檢驗，進行統計學處理,P<0.05為差異有顯著性。

1.4 膽汁收集與內毒素含量測定

1.4.1 膽汁收集 取雄性大白鼠10 只, 隨機分為兩組，一組作對照組，一組作用藥組。膽汁收集實驗操作同1.3項下，并收集膽汁于無熱原試管中。對照組每鼠于十二指腸注入生理鹽水1 ml/100 g體重后，先收集30分鐘的膽汁作為空白，然后尾靜脈注射內毒素溶液0.1 ml/100 g，再收集1小時的膽汁。用藥組每鼠于十二指腸注入利膽排毒口服液1 ml/100 g體重，先收集30分鐘的膽汁作為空白，然后尾靜脈注射內毒素溶液0.1 ml/100 g體重，再收集1小時的膽汁。

1.4.2 尿液收集 1.4項下大鼠膽汁收集完畢后，取出膀胱收集尿液。

1.4.3 樣品處理及內毒素的測定 將收集的膽汁以等量無熱原水和0.4 ml/L的TRIS-HCL緩沖液稀釋400倍，將尿液同法稀釋10倍，并以3500 rpm離心10分鐘。分別取上清液0.1 ml, 加入鱟試劑0.05 ml,混勻，37℃溫育25分鐘；加入鱟三肽0.05 ml, 混勻，37℃溫育3分鐘，然后，依次加入0.5 ml亞硝酸鈉、0.5ml氨基苯磺酸、0.5 ml萘乙二胺進行顯色反應。按試劑盒要求，同時設空白對照和內毒素標準液對照。反應完畢后，以蒸溜水為空白, 在分光光度計上以545 nm 比色。與用藥前比較, 兩組數據間的比較用t檢驗，進行統計學處理,P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 口服液對膽汁分泌的影響

給藥前20分鐘內，膽汁流出總滴數為(15.5±3.5)滴, 給藥后20～40分鐘較藥前增加(4.5±1.5)滴,(P<0.05);給藥后40～60分鐘較藥前增加(5.5±2.5)滴,(P<0.05)。說明利膽排毒口服液有顯著的促進大鼠膽汁分泌的作用。

2.2 口服液對大鼠膽汁及尿液中內毒素含量的影響

對照組及口服液組大鼠膽汁中內毒素含量結果分別為(84.3±12.1)EU/ ml，(51.7±14.4)EU/ ml,P<0.05；對照組及口服液組大鼠尿液中內毒素含量結果分別為(17.2±2.1)EU/ ml，(12.5±1.6)EU/ ml,P<0.05。

3 討論

內毒素機體清除機制研究已表明，肝是清除內毒素的主要器官，脾、腸也是重要器官。肝對血液中內毒素的清除，主要是通過枯否細胞、肝細胞的內吞作用而實現的。內毒素被內吞入細胞后，以微管依賴的囊泡運輸方式，穿過肝細胞，運至肝細胞膽小管面，以胞吐的方式排入膽小管中，再經膽道系統排入腸腔內。免疫組化顯示，從血液循環中清除的內毒素迅速分布到肝、肺、腎等組織巨噬細胞內。內毒素及其代謝產物經巨噬細胞代謝轉運后可逐步由膽道排泄，采用酚/水抽體法從內毒素血癥大鼠膽汁中排出的內毒素，發現它對小鼠仍具極強致死活性[1]。但從目前文獻看，對泌尿道排出內毒素是否是機體清除內毒素的方式與途徑未得到認同，不過現有不多的研究資料已顯示，尿液中確實含有較高濃度的內毒素[2,3]。因此，研究膽汁及尿液中內毒素的含量變化對了解機體清除內毒素的功能具有重要意義。

實驗結果表明，利膽排毒口服液給大鼠注入后能促進大鼠膽汁分泌, 表明該制劑具有利膽作用。實驗也表明，大鼠注射內毒素后，膽汁中確實存在大量的內毒素。在病理情況下如膽道阻塞不通暢，則會使內毒素停留于體內，引發或加重內毒素血癥。因而，利膽排毒口服液的利膽作用將促進內毒素的排出，增強機體清除內毒素的能力，從而有助于內毒素血癥的治療。

結果表明，用藥后大鼠膽汁及尿液中內毒素含量均降低，其原因可能是中藥直接降解內毒素，使循環中內毒素量減少，從而導致排出減少；另一種原因是中藥的利膽作用，使膽汁分泌增加，單位體積內內毒素含量下降。

尿液中內毒素含量測定表明，尿液中也存在一定量的內毒素，文獻資料及本研究結果可以說明，泌尿道排出內毒素也應是機體清除內毒素的方式與途徑之一。中藥的利尿作用也將有助于內毒素血癥的治療。

[1]Van Bossuuyt H,De Zanger RB,Wisse E. Cellular and subcellular distribution of injected lipopolysaccharide in rat liver and its inactivation by bile salts[J]. hepatol ,1988,7:325-337

[2]劉竟，崔乃強，趙琪,等. 腸源性內毒素移位后的體內分布[J].中國急救醫學, 2000,20(3) :146-147.

[3]卜一珊，徐彥貴，郭震，等. 動態濁度法測定尿液中內毒素含量及臨床應用[J].中國醫院藥學雜志.2003，23(6)：335-337.