滋水清肝飲對圍絕經期抑郁癥模型大鼠海馬神經元細胞凋亡相關因子的影響

趙珂 金季玲

圍絕經期抑郁癥是指初次發病于圍絕經期，以情緒低落、焦慮不安、失眠為主要癥狀的疾病[1]。對圍絕經期抑郁癥的流行病學調查顯示：我國圍絕經期抑郁癥患者占圍絕經期人群的5.8%[2]，占圍絕經期綜合征患者的78%[3]。近年來因中醫藥治療本病療效肯定且毒副作用少而日益引起關注。本課題采用動物實驗研究的方法，應用具有補腎疏肝、寧心安神作用的滋水清肝飲為治療藥物，應用免疫組化法，從海馬神經元細胞凋亡及其相關基因蛋白表達的角度探討了圍絕經期抑郁癥中藥治療的干預環節。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD清潔級大鼠45只，體重200～230 g，由北京中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，使用許可證編號：SCXK-(軍)2002-001。

1.2 實驗藥品

中藥：根據滋水清肝飲方制備。方藥組成：熟地12 g，山茱萸12 g，山藥12 g，丹皮10 g，澤瀉10 g，茯苓10 g，白芍12 g，當歸12 g，柴胡10 g，酸棗仁15 g，梔子10 g。

西藥：鹽酸氟西汀膠囊，每粒20 mg。生產廠：Eli Lilly and Company Limited Kingsclere Road，Basingstoke，分裝廠：禮來蘇州制藥有限公司。

雌二醇注射液：每支1 mg。生產廠：天津金耀氨基酸生產有限公司。

1.3 主要儀器及試劑

全自動切片機、全自動多功能顯微鏡、數碼采集及分析系統、染色缸、濕盒、孵育箱、蓋玻片、光鏡、微量移液器等。原位細胞凋亡檢測試劑盒TUNEL(天津灝陽生物公司批號：TBD2020POD)；Bax免疫組化成套染色系統(天津灝陽生物公司批號：RSC526K)；Bcl-2免疫組化成套染色系統(天津灝陽生物公司批號：RSC492K)。

1.4 模型建立與實驗分組

將實驗大鼠按照體重分層隨機分組(隨機數字表法)。每組9只。假手術組；圍絕經期抑郁癥模型組(簡稱模型組)；圍絕經期抑郁癥滋水清肝飲治療組(簡稱中藥組)；圍絕經期抑郁癥雌二醇+鹽酸氟西汀治療組(簡稱雌二醇+鹽酸氟西汀組)；圍絕經期抑郁癥雌二醇治療組(簡稱雌二醇組)。假手術組行假手術。其余各組大鼠分別行卵巢摘除術及慢性不可預見應激，造成圍絕經期抑郁癥動物模型。實驗過程中6只大鼠死亡，其中模型組、雌二醇+鹽酸氟西汀組灌胃時各死亡1只，中藥組冰水游泳淹死2只，雌二醇組禁食時死亡1只，熱水游泳淹死1只。

1.5 給藥

第一輪刺激結束后開始給藥，連續給藥21天。所給藥物按照臨床人用劑量，根據每公斤體重用藥量的人鼠比例換算[4]，由本院制劑室加工成水煎劑，使每毫升含生藥1.0 g，置冰箱保存備用。

中藥組、雌二醇+鹽酸氟西汀組、雌二醇組在第一輪刺激結束后開始給藥。中藥組給予滋水清肝飲(11.25 g生藥/kg)灌胃，每日1次；雌二醇+鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀混懸液(1.8 mg/kg)灌胃每日1次加雌二醇(0.18 mg/kg)隔日1次肌內注射；雌二醇組給予雌二醇肌內注射隔日1次。3組均連續給藥21天。假手術組、模型組分別給予生理鹽水2 ml/d灌胃。

1.6 動物處死及取材

末次治療24小時后，頸椎脫臼法處死大鼠，迅速斷頭，于冰盤上迅速分離全腦，右側半腦稱量濕重后，置于中性福爾馬林液固定，用于免疫組化切片。采用石蠟包埋切片法。

1.7 免疫組化的實驗步驟

參照原位細胞凋亡檢測試劑盒TUNEL、Bax免疫組化成套染色系統、Bcl-2免疫組化成套染色系統、說明書提供的實驗步驟，由天津灝洋生物公司協助完成。

1.8 觀察方法

每只大鼠取2張相應部位切片，每張切片隨機取海馬CA3區的5個高倍視野(40×10)進行分析。Tunel法檢測細胞凋亡其陽性染色者為細胞核著色，呈棕黃色者為陽性細胞，著色越重，凋亡程度越高。Bcl-2、Bax的陽性染色者為細胞胞漿著色呈棕黃色，著色越重，蛋白表達越高。對圖像采用HPIAS-2000圖像分析系統進行平均灰度值的分析，進行統計學比較。凋亡神經細胞記數方法：記數凋亡細胞和陰性神經細胞的平均數，計算凋亡細胞所占的百分率。以之為凋亡指數進行統計學比較。

2 實驗結果

2.1 各組細胞凋亡結果比較

模型組與假手術組比較，凋亡指數升高，有顯著性差異(P<0.01),經過治療后，中藥組和雌二醇+鹽酸氟西汀組可以降低升高的凋亡指數，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，其中中藥治療后與假手術組比較無差異。兩組西藥療效與中藥組比較有顯著性差異(P<0.01)，中藥療效明顯優于西藥組。見表1。

表1 細胞凋亡指數比較

注：與假手術組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與中藥組比較dP<0.01。

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化結果平均灰度值比較

模型組和假手術組比較，Bax的蛋白表達量升高，有顯著性差異(P<0.01),Bcl-2的蛋白表達量降低，亦有顯著性差異(P<0.01)。經過治療后，Bax的表達量降低，其中以雌二醇+鹽酸氟西汀組及中藥組療效最好，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，與假手術組比較差異無統計學意義。Bcl-2的表達三組治療后呈升高趨勢，以中藥組及雌二醇+鹽酸氟西汀組療效最好，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，與假手術組比較差異無統計學意義。

表2 Bax和Bcl-2免疫組化結果平均灰度值比較

注： 與模型組比較aP<0.05；與假手術組比較bP<0.05，cP<0.01

3 討論

本課題組在金季玲教授的帶領下通過多年的臨床及實驗研究最終確立了圍絕經期抑郁癥的主要病機是腎精不足、肝氣郁結、心神失守最終導致腦府失養發為本病?；诖舜_立了補腎疏肝、寧心安神的治療原則，選取滋水清肝飲治療該病，并且在以往的臨床觀察中顯示了一定的優勢。抑郁癥的發生與腦府失養的密切關系，歷代醫家皆有論述?！鹅`樞·海論篇》說：“腦為髓之海，其輸上在于其蓋，下在風府，……，髓海有余，則輕勁多力，自過其度；髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥?！薄端貑枴っ}要精微論》云：“頭者，精明之府。”明確提出了腦的解剖位置及與神明相關的功能?？梢姡嗅t早在內經時代己經明確認識到腦在精神意識思維活動中的重要性。明代醫家李時珍在《本草綱目·辛夷條》提出了“腦為元神之府”，清代醫家王清任在《醫林改錯》中指出：“靈機記性在腦不在心……所以小兒無記性者，腦髓未滿，高年無記性者，腦髓漸空。”《普濟方》載有：“頭者，諸陽之會，……百神所聚”，喻昌《醫門法律》言：“腦之為上天門，身中萬神集會之所。”強調了腦總統眾神，腦是精神及思維活動的發源地，一切精神及思維活動的障礙均源于腦。

本實驗結果顯示：模型組細胞核著色程度最強，陽性細胞數最多，說明模型組細胞凋亡程度最高。經過治療后，中藥組和雌二醇+鹽酸氟西汀組的凋亡細胞指數顯著降低，且中藥組療效明顯優于雌二醇+鹽酸氟西汀組，中藥組陽性細胞數明顯減少，著色程度輕，接近于假手術組。說明中藥可以有效抑制海馬神經元細胞凋亡的過程。通過對凋亡相關基因Bax，Bcl-2的研究表明：在模型組中促進細胞凋亡的Bax表達量較假手術組顯著增強，抑制細胞凋亡的Bcl-2的表達量顯著降低。中藥治療可以調節Bax，Bcl-2的表達量，增進抑凋亡基因Bcl-2的表達，降低促凋亡基因Bax的表達。這可能是中藥抑制細胞凋亡，延緩神經元退行性變的作用機制之一。海馬神經元細胞凋亡是海馬功能發生改變的基礎，可能是圍絕經期抑郁癥發生的病理機制之一。中藥滋水清肝飲及雌激素加抗抑郁藥物的治療都能改善這一病理狀態，但是從療效看，中藥組顯著優于西藥組，其療效接近于假手術水平。滋水清肝飲對細胞凋亡的調節是通過作用于細胞凋亡相關基因Bcl-2家族的促進及抑制細胞凋亡的一對相關基因而起效的。

[1]林守清，徐苓.女性生殖內分泌性激素補充療法[M].北京：中國協和醫科大學出版社，1999:36-37.

[2]何敏慧，馮永林，王政科．城市社區更年期居民抑郁、焦慮狀況及影響因素[J]．中華精神科雜志，1999，4(32)：22-23.

[3]衛生部繼續醫學教育委員會．女性生殖內分泌性激素補充療法[M]．北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1999:36.

[4]陳奇.中藥藥理研究方法學.北京：人民衛生出版社，1994.