PgP介導(dǎo)的多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展

張正平,孫 勇,張正慧,孫啟峰

(1.山東省萊蕪市高莊醫(yī)院,山東萊蕪 271100;2.山東省萊蕪市人民醫(yī)院,山東萊蕪 271100;3.山東省萊蕪市牛泉醫(yī)院,山東萊蕪 271100)

腫瘤的化療是其綜合治療的一個重要方面,而多藥耐藥(MDR)的影響是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。國內(nèi)外對逆轉(zhuǎn)MDR也進(jìn)行了很多研究工作,在各種引起MDR的機(jī)制中,以P糖蛋白(PgP)介導(dǎo)的 MDR占重要方面,針對逆轉(zhuǎn)PgP介導(dǎo)的MDR的研究也較多,主要包括化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑、單克隆抗體和基因水平調(diào)控等方面,本文是對PgP介導(dǎo)的 MDR的逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展做一個簡要綜述。

所謂MDR系指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時,對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉抗藥性,它是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象[1],PgP是一種ATP依賴性的跨膜外流泵,可將細(xì)胞內(nèi)化療藥物排出細(xì)胞外,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的蓄積濃度降低而不能有效殺死腫瘤細(xì)胞,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。幾乎所有人類腫瘤細(xì)胞均有不同程度的PgP表達(dá),但是對化療不敏感或療效差的腫瘤往往有較高的PgP表達(dá)水平[2],目前對PgP介導(dǎo)的MDR的逆轉(zhuǎn)的研究主要從以下幾個方面進(jìn)行。

1 化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑

1.1 鈣離子通道阻滯劑和鈣調(diào)素抑制劑：鈣離子通道阻滯劑是最早發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)MDR作用的藥物,主要有Verapamil(VER)及其衍生物、雙氫吡啶類化合物以及硫氮卓酮等。研究表明,鈣離子通道阻滯劑在 mdrl基因的翻譯水平上抑制Pgp的合成及活性,增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度,克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性,提高化療效果。但由于這些藥物對心血管系統(tǒng)有 -定毒性,所以限制了它們在臨床上的應(yīng)用。Micktsch等報告在 VER的衍生物中 R-ver和 nor-VER具有鈣離子通道阻滯作用很小,同時又具有較低的細(xì)胞毒性和較高的逆轉(zhuǎn)能力的特性,故 R-ver和 nor-VER最有希望用于臨床。具有MDR逆轉(zhuǎn)作用的鈣調(diào)素抑制劑主要包括三氟拉嗦、三氟丙嗦、氯丙嗦、氟奮乃靜等吩噻嗪類化合物,其作用機(jī)制與鈣離子通道阻滯劑相似。

1.2 免疫抑制劑環(huán)孢霉素 A(Cs A)及其類似物：無免疫抑制作用的 CsA衍生物 SDZ PSC833在體內(nèi)外均能夠逆轉(zhuǎn)MDR 1基因的表達(dá),阻止MDR克隆的形成,國外已將該藥用于難治性白血病和實(shí)體瘤的臨床研究[3,4];還有報道環(huán)孢霉素A及其衍生物 PSC 833可以明顯改變抗腫瘤藥物的藥代動力學(xué),使血藥水平提高、減慢藥物的體內(nèi)代謝[5],而PSC833的逆轉(zhuǎn)作用是環(huán)孢霉素 A的 5～10倍,且無環(huán)孢霉素A的免疫抑制作用和腎毒性,目前已進(jìn)人臨床試驗。

1.3 抗激素類化合物：雌激素非完全拮抗劑三苯氧胺(Tamoxifen)作為 MDR逆轉(zhuǎn)劑已用于臨床。Kirk等在對 5種新的抗雌激素衍生物的逆轉(zhuǎn)耐藥效果的研究中發(fā)現(xiàn),雌激素完全拮抗劑ICⅡ64的逆轉(zhuǎn)效果更好,它使阿霉素和長春新堿對MDR細(xì)胞 MCF-7/adr的毒性分別增加 25,35倍。ICⅡ64能完全逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染了 mdrl基因的肺癌細(xì)胞 Sl/1.1對長春新堿的耐藥,阻斷 Pgp對長春新堿的泵出。抗孕酮化合物 RU486是孕酮化合物的衍生物。RU 486在低濃度((1μmol/L)時就可以有效抑制小鼠 Pgp的泵出功能,增加化療藥物蓄積,對人的 Pgp也有同樣的效果。有人認(rèn)為,RU486結(jié)構(gòu)中的 1位(β-dimethylaminophenyl)取代基對于其拮抗劑Pgp功能發(fā)揮起到了重要作用,可見類固醇衍生物也是一類可以抑制Pgp泵出的逆轉(zhuǎn)劑。

1.4 蛋白激酶抑制劑：蛋白激酶(PKC)可以改變藥物在MDR細(xì)胞中的蓄積,在一些 MDR的腫瘤細(xì)胞 P KC的活性增加,推測抑制 P KC的活性可以對抗 MDR的發(fā)生。CGP41251是高度選擇性的PKC抑制劑,具有抗腫瘤作用及有效的耐藥逆轉(zhuǎn)作用,它可使 3種 MDR細(xì)胞系對阿霉素和長春新堿的敏感性增加。Pgp是一個 ATP依賴的“藥泵”,CGP41251可能是直接與 Pgp競爭 ATP或通過競爭 Pgp上的藥物結(jié)合位點(diǎn),從而阻斷了Pgp的泵出功能,達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用.目前,對 CGP41251逆轉(zhuǎn)機(jī)制尚不清楚,需進(jìn)一步研究。KT-5720是另 -具有逆轉(zhuǎn)MDR的蛋白激酶抑制劑,在非毒性的濃度下可有效增加耐藥細(xì)胞 KB-V1、HU-1對化療藥物的敏感性,其抗耐藥機(jī)制尚不清楚。

1.5 表面活性劑：表面活性劑如吐溫 80,gremophorEL以及solutol HS15等被證明可以逆轉(zhuǎn) MDR,CRL1337是一種ethoxylated oleicacid制劑,它比 solutol和 gremophor表現(xiàn)出更高的耐藥逆轉(zhuǎn)活性。

1.6 多芳基取代咪唑類化合物：阮繼武等人用設(shè)計并合成了幾個新的多芳基取代咪唑類化合物(I一V),并選擇了兩種腫瘤耐藥細(xì)胞株KBV和 M CF-7/adr,采用MTT法測定了其對由 P-gP介導(dǎo)的MDR的逆轉(zhuǎn)效果.結(jié)果表明,化合物II和III具有很好的體外逆轉(zhuǎn) M DR活性(已申請專利保護(hù)[6]。

1.7 其他：除上面幾種主要的逆轉(zhuǎn)劑以外,5-溴甲苯[7],FK 506以及其結(jié)構(gòu)類似物Rapamycin,新的哇琳化合物MS-209,精胺聚合物 Poly-SPM.(polymeric conjugate of spermine),十字花科蔬菜中富含的代謝產(chǎn)物Indole-Carbinol(13 C),還有一些化合物也具有MDR的逆轉(zhuǎn)作用。

2 單克隆抗體

單克隆抗體是采用耐藥細(xì)胞或耐藥細(xì)胞膜蛋白作為抗原而制備的,可特異性識別、結(jié)合Pgp的胞膜外部分,從而逆轉(zhuǎn) MDR 1表型。將藥物與單抗相連,借助抗原-抗體的生物特異識別機(jī)制,可實(shí)現(xiàn)藥物的主動靶向。脂質(zhì)體表面交聯(lián)單克隆抗體制成的免疫脂質(zhì)體可滿足多種實(shí)際需要.抗 PgP的單抗能夠抑制MDR細(xì)胞對PgP底物的外排,增加PgP運(yùn)輸藥物的細(xì)胞毒性。實(shí)驗證明,CD19的單克隆抗體可以抑止CD19和 PgP的相互作用,可導(dǎo)致淋巴瘤的 MDR逆轉(zhuǎn)[8]。單克隆抗體FC-2.15能夠識別腫瘤細(xì)胞膜表面的糖類抗原表面決定簇,并能夠連接白細(xì)胞表面糖蛋白,然后通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用溶解細(xì)胞。FC-2.15可在補(bǔ)體的作用下明顯提高人類乳腺癌細(xì)胞對阿霉素和紫杉醇的敏感性[9]。應(yīng)用 PgP的單克隆抗體MRK-16可以封閉 PgP的離子通道,從而阻止細(xì)胞化療藥物的外流,充分發(fā)揮化療藥物細(xì)胞毒性作用。在小細(xì)胞肺癌的動物模型實(shí)驗中,應(yīng)用 MRK-16單克隆抗體可以抑制SCID大鼠細(xì)胞的耐藥性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,同時提高大鼠的生存率[10]。這可能因為抗體不僅可以直接針對原位腫瘤細(xì)胞的PgP產(chǎn)生抗性,而且可以進(jìn)入血液循環(huán)對轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。

3 基因水平調(diào)控

近年來,國內(nèi)外開始將反義技術(shù)應(yīng)用于腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究。根據(jù)堿基互補(bǔ)原理,設(shè)計出能特異地同相應(yīng)靶基因結(jié)合的RNA或DNA,影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,以達(dá)到特異抑制靶基因表達(dá)的基因調(diào)控技術(shù),包括反義 RNA(AntisenseRNA)技術(shù),反義 DNA(Antisense DNA)技術(shù),又稱反義寡核苷酸(Antisense oligodoxynucleotide,ASODN)技術(shù)、核酶(Ribozyme)技術(shù)。

3.1 MDR1基因的反義寡核苷酸(ODN)：MDR 1基因為一個較小的基因家族,雖然其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程尚不十分清楚,但已有研究證實(shí)其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)部位在MDRl基因 5'端上游非編碼區(qū)內(nèi),設(shè)計這段反義基因,發(fā)現(xiàn)能使耐藥的腫瘤細(xì)胞得到逆轉(zhuǎn)。李惠芳等利用互補(bǔ)于MDR 1基因5'末端轉(zhuǎn)錄起始部位的ODN直接轉(zhuǎn)染表達(dá)MDR 1基因的耐藥細(xì)胞株KB-8-5后,細(xì)胞內(nèi) Pgp表達(dá)水平下降,為弱陽性,細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)濃度提高,被轉(zhuǎn)染細(xì)胞對藥物的LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 3.2倍。以上結(jié)果說明 ODN逆轉(zhuǎn)了PgP介導(dǎo)的藥物耐受性,但逆轉(zhuǎn)作用不完全.作者分析其原因之一為ODN的降解問題.為此,作者以脂質(zhì)體 Lipofectin作為轉(zhuǎn)基因載體,使 ODN的耐藥逆轉(zhuǎn)作用有所提高,被轉(zhuǎn)染細(xì)胞對DNR的 LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 2.5倍,提示脂質(zhì)體可作為引導(dǎo) ODN靶向治療的方式之一,另有作者則認(rèn)為對核酸上的氧原子進(jìn)行硫代化、甲基化或用脂質(zhì)體進(jìn)行包裹等方法在提高細(xì)胞攝入ODN的同時,一方面增加了細(xì)胞毒性,同時也降低了核酸反義抑制的效應(yīng).將低相對分子質(zhì)量的聚乙二醇(PEG)連接在 ODN的 5'的末端,結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi) ODN攝入率明顯增加,高于其他修飾方法,且不影響細(xì)胞的生長特性,說明 ODN的 5'末端連接PEG在反義治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 MDR1基因的反義 RNA：ODN的作用是封閉 MDR 1基因而影響基因的轉(zhuǎn)錄,反義RNA則是與MDR 1基因的 mRNA形成二聚體而抑制 mRNA的翻譯。曹江等利用高表達(dá)反義MDR1-RNA重組質(zhì)粒 pRMAS轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞 K562/Dox后,其 P-糖蛋白近乎陰性,細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度與敏感細(xì)胞系K 562幾乎一致,說明 P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排幾乎完全被抑制,顯示將反義 RNA的模板DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),可產(chǎn)生大量反義RNA抑制 MDR1基因表達(dá)。資料還顯示,細(xì)胞除對阿霉素的耐受性完全被逆轉(zhuǎn)外,對長春新堿(VCR)和柔紅霉素(DNR)的耐受性仍保留 9.0倍和 14.1倍以上,說明 PgP表達(dá)轉(zhuǎn)陰后,MDR并不能完全逆轉(zhuǎn),提示還有其他機(jī)制作用于細(xì)胞的MDR。最近,Nieth等報道應(yīng)用反義RNA技術(shù)抑制胰腺癌細(xì)胞株 EPP85-181RDB和腸癌細(xì)胞株EPG 85-257RDB中MDR1基因的 91%的表達(dá),兩種細(xì)胞對化療藥物柔紅霉素的耐藥性分別降低到 89%和58%,該研究表明特異性阻斷針對PgP依賴的 MDR基因表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性[11]。

3.3 切割MDR 1mRNA的核酶：核酶(Ribazyme)是正常存在于細(xì)胞內(nèi)并調(diào)控基因表達(dá)的RNA,是一類具有 RNA限制性內(nèi)切酶活性的小分子RNA,它特異地與靶 RNA的特定位點(diǎn)結(jié)合,識別 RNA序列的 GUN X為 A,C,G)序列并進(jìn)行切割阻斷目的基因表達(dá),其模型特征具有錘頭結(jié)構(gòu)(Hammerhead)、發(fā)夾狀,其結(jié)構(gòu)相對簡單,可以降解 m RNA,因此也稱為“分子剪刀”。Kobayashi等[12]合成兩個核酶基因,分別切割MDRImRNA 196位和 179位密碼子,將切割 MDRl m RNA 196位密碼子的核酶構(gòu)建于pHβAPrlneo載體上,電穿孔法導(dǎo)入到耐藥的人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞系 MOLT3/TMQ800中,轉(zhuǎn)染核酶后 MOLT3/TMQ 800對 VCR的耐藥性由原來的 700倍(與其母細(xì)胞 MOLT3比較)下降至 20～30倍。在耐藥的胰腺癌細(xì)胞系應(yīng)用核酶逆轉(zhuǎn) MDR,耐藥性更是由原來的 1600倍下降至 5.3倍。

目前通過細(xì)胞內(nèi)注射法、電穿孔法、氯化鈣、脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行外源性導(dǎo)入,但在導(dǎo)入細(xì)胞過程中極易被核酶降解。用化學(xué)方法對核酶加以修飾,可以提高其抵抗核酸酶的能力,但其生物活性明顯減弱。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒的內(nèi)源性導(dǎo)入,有病毒滴度低、只能逆轉(zhuǎn)分裂期細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)率低和潛在致癌性等缺點(diǎn)。Lieber等應(yīng)用腺病毒載體將核酶基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),證實(shí)了核酶基因在完整器官內(nèi)可以有效表達(dá)并發(fā)揮其切割活性。

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