腦啡肽酶與阿爾茨海默病的研究進展

唐璟群綜述,晏 勇審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科/重慶市神經病學重點實驗室 400016)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是老年人群中最常見的進行性神經變性疾病,主要臨床表現為進行性認知及記憶功能喪失、精神行為異常等,是繼冠心病、腫瘤和卒中之后的第4位主要死亡原因。AD主要病理學特征是細胞外老年斑沉積、細胞內神經原纖維纏結和神經元丟失等。其病因多樣、發病機制復雜。目前廣泛認同AD發生的核心機制是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。過去主要圍繞Aβ生成增多和異常沉積的研究已碩果累累,揭示了多種蛋白酶類代謝異常和分子調控通路異常,而對Aβ降解減少導致過度沉積在AD發病中的作用研究較少。近年來部分研究揭示降解Aβ的酶主要有腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)、胰島素降解酶(IDE)、內皮素轉換酶-1(ECE-1)和內皮素轉換酶-2(ECE-2)等,其中NEP是腦實質內最主要的Aβ降解酶。現將近年來的研究進展綜述如下。

1 NEP的生化特性

NEP(也稱EC 3.4.24.11)位于細胞表面,屬中性內肽酶M13家族中1個含鋅離子的Ⅱ型膜蛋白,相對分子質量為97×103D,包括1個短的N-末端胞內結構域、1個跨膜螺旋和1個大的C-末端胞外催化結構域,其細胞外結構域有1個與催化作用有關的Zn2+結合序列(HExxH)的活性位點及參與二硫鍵構成的12個半胱氨酸殘基[1-3]。NEP廣泛分布于哺乳動物的腎臟、前列腺、睪丸、肺等組織中。用放射性自顯影技術及酶活性檢測發現,在腦內NEP主要分布于尾狀核、蒼白球、黑質、嗅球和脈絡叢部位,在海馬、大腦皮質、上下丘腦、杏仁核和中央灰質等部位次之。NEP由神經元內質網及高爾基體內合成并成熟,經軸突轉運至分泌囊泡及突觸前膜表面[4]。作為胞外酶,其水解作用發生在疏水氨基酸殘基的氨基側,優先水解細胞外小于5×103D的寡肽(5～40個氨基酸殘基)。NEP對相對分子質量較小的 Aβ(含 40～42個疏水氨基)的降解具有重要作用。在體外實驗中NEP能降解多種生物活性肽,如腦啡肽、生長抑素、膽囊收縮素、心房利鈉肽、緩激肽、內皮素和P物質等,但在體內試驗中僅有 NEP降解Aβ的證據[3]。

2 NEP與AD發病機制的研究

2.1 NEP與Aβ的分解代謝 Aβ由經軸突轉運的淀粉樣前體蛋白(APP)在突觸前膜經過β-分泌酶(BACE1)及γ-分泌酶共同裂解產生。有兩種構像,一種是難溶性的β折疊(Aβ ac),能迅速生成淀粉樣沉積;另一種是可溶性的螺旋形結構(Aβnac),很難形成淀粉樣纖維。Aβ纖維化后形成淀粉樣沉積,產生神經毒性,或直接導致神經元功能障礙。Aβ在腦內被合成和降解,其穩態水平取決于合成和分解代謝間的平衡。研究揭示,隨著年齡的增加NEP的活性下調、NEP基因缺陷或敲除該基因或于APP轉基因鼠腦內注入NEP抑制劑等均引起Aβ降解減少而導致Aβ沉積和記憶損害,說明腦內NEP的主要特定功能之一是調節Aβ的分解代謝。Li等[5]持續3 d向小鼠腦室內注入NEP抑制劑——四氫噻吩,發現海馬區內源性Aβ 40及Aβ42的不溶性片段沉積,且在 Morris水迷宮試驗、物體識別試驗和聯想學習試驗方面均表現出明顯的學習及認知功能受損。Hemming等[6]將由慢病毒介導的轉染NEP基因的原始成纖維細胞注入已形成淀粉樣斑的APP轉基因鼠腦內,發現細胞移植位點及海馬區內的淀粉樣斑數量明顯減少。El-Amouri等[7]使用慢病毒載體作為基因轉移系統在APP/ΔPS1轉基因鼠皮質及海馬區過度表達人NEP,4個月后檢測結果顯示,腦內淀粉樣斑的數量減少了50%;左側大腦半球Aβ40及 Aβ42的濃度分別降低了33%及40%,說明NEP的過度表達對增強Aβ降解、減少Aβ沉積及老年斑形成起了重要作用。Spencer等[8]向6個月齡的APP轉基因鼠雙側大腦半球注入慢病毒載體介導的NEP(LV-NEP),6個月后經免疫印記分析發現,APP轉基因鼠腦皮質及海馬區NEP表達較對照組明顯增高、活性增強。神經病理檢查顯示長達6個月的LV-NEP治療可減少轉基因鼠皮質區48%和海馬區25%淀粉樣物質沉積。

Guan等[9]通過慢病毒移植骨髓細胞的轉導,在3xAg-AD鼠(129/C57Bl6/CD45.2)中成功地將NEP表達在白細胞表面,使Aβ降解為相對分子質量更小且無害的肽片段,促進Aβ從腦內向血漿運送及阻止外周血中的Aβ再進入腦內,最終使腦內Aβ水平降低了約30%,Aβ沉積物減少了50%～60%。Mohajeri和Wolfer[10]最近將敲除編譯NEP的等位基因 Mme及過度表達人APP的雙突變小鼠與APP基因改造鼠相比較,發現雙突變鼠表現明顯的淀粉樣變性,且在Morris水迷宮學習記憶及條件性厭食試驗中均有明顯的認知功能損害。這表明即使NEP的部分缺乏(如同人類的老齡化過程),亦加劇了淀粉樣變性的病理,并可能損害認知功能。

2.2 NEP的分布與Aβ的沉積 NEP在腦內的分布范圍與Aβ的沉積區域呈反向關系,即Aβ的沉積區域內NEP分布最少。Iwata等[11]研究發現,NEP基因部分缺陷或活性部分下調均可引起內外源性Aβ的降解不足,導致Aβ過度沉積。在NEP基因缺乏的小鼠腦內,Aβ區域性分布在海馬、大腦皮質、丘腦/紋狀體、小腦,其中海馬區含量最高,小腦最少,與 Aβ在AD患者腦內的分布一致。Fukami等[12]研究發現,NEP在海馬區主要分布于CA1～3區的網狀分子層及齒狀回分子層,其次分布在透明層、齒狀回多形細胞層、顆粒層以及海馬錐體細胞層,而在CA1～3區的始層、輻射層及下腳最少。相反,Aβ則主要出現在NEP分布較少的CA1～3區的始層、輻射層及下腳。

Takeuchi等[13]用免疫組化分析研究不同年齡段的狗與貓腦內的NEP表達、活性及與Aβ的分布關系,發現在腦內NEP主要分布于尾狀核、殼核、蒼白球及黑質,其次為大腦皮質,而白質、小腦和海馬幾乎無NEP分布,各年齡段間無明顯差別。在狗與貓腦內的NEP活性由高到低排列為丘腦/紋狀體、大腦皮質、海馬、白質。同時,他們研究 7歲和 9個月的狗及 10歲的貓腦內Aβ的沉積發現,年齡越大Aβ沉積的數量與頻率越高,且以彌漫沉積或彌漫性老年斑這兩種形式主要沉積在大腦海馬區及皮質,而白質、尾狀核、殼核、蒼白球、黑質及小腦內無Aβ沉積。研究結果顯示腦內 NEP與 Aβ的分布存在互補關系。

2.3 NEP減少Aβ所致的神經損傷 NEP的正常表達可有效地降解Aβ,減少 Aβ過度沉積所致的神經損傷。El-Amouri等[14]于2007年研究體外慢病毒載體介導的NEP過度表達保護神經元細胞免受Aβ毒性的效能。通過檢測細胞的生存率,發現在表達人NEP的海馬神經元HT22(HT22-hNEP)細胞中,經不同濃度的 Aβ1-40和 Aβ 1-42處理后,神經元細胞的生存能力均明顯增強。由此推論,給AD患者腦內Aβ聚集的區域移植NEP基因就可減輕Aβ對神經元的毒性效應,可望成為AD治療的靶點。

2.4 NEP改善 Aβ所致的空間記憶功能受損 NEP是 Aβ的主要降解酶,可減少老年斑的形成及相關神經病理改變和臨床癥狀。Huang等[4]于 2006年將APP轉基因鼠(APP23)與NEP缺乏鼠雜交(NEP-/-APP+),用Y型迷宮、物體識別試驗、Morris水迷宮、條件恐懼學習等學習和記憶模型檢測13～16周齡NEP-/-APP+鼠的空間工作記憶、視覺識別記憶、采集和保留相關記憶、聯想記憶等,結果發現NEP-/-APP+鼠與海馬區相關的認知功能均表現明顯的損害。El-Amouri等[7]研究發現6～8個月齡的APP/ΔPS1轉基因鼠存在大量的淀粉樣斑沉積與空間記憶功能損害。而給腦內注入慢病毒載體介導的人NEP及綠色熒光蛋白的APP/ΔPS1轉基因鼠在4個月后的Morris水迷宮試驗的空間學習及記憶能力等方面較對照組明顯增強。

3 影響NEP的因素

圍繞AD特征性病理改變進行的多種研究發現高齡、基因突變、糖代謝異常、脂代謝異常、氧化應激、炎癥反應、雌激素缺失、神經肽能神經遞質功能缺損等多個環節參與AD的發病[15]。此外,亦有因素,如人參皂苷 Rg3、生長抑素、HIV-1 Tat等通過影響NEP的活性及表達,分別從不同的方向調控NEP表達,進而影響AD的發生發展,成為AD治療策略的研究熱點。

3.1 上調NEP的因素

3.1.1 人參皂苷Rg3 人參皂苷Rg3對脂多糖(LPS)誘導的多種細胞株中 NEP表達影響的多項研究表明,人參皂苷Rg3可減輕LPS對細胞內NEP表達的抑制,增加細胞內NEP的表達,對LPS造成的細胞毒性具有一定的保護作用,提示該物質有可能成為NEP的激活劑用于治療AD。Yang等[16]于2009年研究在轉染了瑞典突變的APP(SweAPP)的SK-N-SH細胞中人參皂苷Rg3對NEP的影響。免疫印跡發現人參皂苷Rg3以濃度依賴及時間依賴方式通過G-蛋白偶聯受體介導的信號通路,明顯增加NEP基因的表達,實時PCR分析發現,人參皂苷Rg3主要通過影響NEP轉錄水平增加其活性,進而明顯降低Aβ 40及 Aβ42的水平,改善AD的神經損傷及認知損害。

3.1.2 生長抑素 生長抑素是一種神經肽,通過G-蛋白偶聯受體信號通路起作用,其在腦內水平隨著年齡增長而明顯下降。Saito等[17]于2005年進行的體外實驗顯示,生長抑素可上調NEP的活性,且呈劑量依賴性增強,但是生長抑素缺乏不會引起NEP的mRNA和蛋白水平降低。根據體外實驗推測生長抑素對NEP調節可能是通過翻譯后過程,如增加NEP代謝和細胞定位等。Hama和Saido[18]于2005年為確定生長抑素在體內是否調節NEP的活性,測定了敲除生長抑素小鼠腦組織中的NEP,發現在海馬及顳葉皮質區NEP活性明顯下降,Aβ l-42的濃度增高了50%。體內外實驗表明,生長抑素可以通過影響NEP的表達及突觸前定位調節NEP活性,并引起腦內Aβ1-42濃度區域選擇性降低。Aβ25-35是 Aβ1-40降解產生的毒性片段,生長抑素受體(SSTR)是生長抑素的神經調節信號,Burgos-Ramos等[19]于2008年研究發現向鼠腦室內注入Aβ25-35明顯降低顳葉皮質生長抑素樣免疫反應及生長抑素受體亞型-2(SSTR2)的mRNA和蛋白水平,其水平的降低能影響生長抑素上調NEP的活性,促進Aβ沉積。

3.2 下調NEP的因素

3.2.1 缺氧及氧化應激 除老年期隨年齡增加NEP活性逐漸降低外,一些常見的腦部病理改變,如缺氧、中風、創傷等也與此有關。一些研究證明缺血、缺氧引起腦內NEP的分泌與活性降低。Nalivaeva等[20]研究短暫性腦缺血發作(TIA)和缺氧對NEP的影響,發現缺血、缺氧條件下 NEP的水平降低,再灌注后部分回復到原水平。產前輕度缺氧導致產后紋狀體NEP表達水平下降,缺氧預處理通過血管內皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR-2)途徑可起到神經保護作用。長期缺氧影響酶活性,進而引起基因表達及蛋白合成的變化,Fisk等[21]通過比較缺氧及氧化應激對人神經母細胞瘤NB7細胞NEP表達的影響,發現慢性缺氧導致NEP mRNA水平降低40%、蛋白水平降低 25%,而氧化應激分別為20%、30%。

3.2.2 HIV-1 Tat 因人類免疫缺陷病毒(HIV)相關性癡呆(HIV-associated dementia,HAD)具有與AD的Aβ沉積所致相同神經病理學改變,近年來備受關注。HAD腦內存在某些細胞因子如白介素-1、IFN-α、TNF-α等可以增加γ-分泌酶的活性,從而促進APP裂解為毒性Aβ片段。HIV-1基因能夠編碼一種被稱為反式轉錄激活因子(transactivator of transcription,Tat)的蛋白,它是由2個外顯子構成的非糖基化蛋白,在HIV復制過程中起重要的作用。Rempel和Pulliam[22]利用人腦神經細胞膜的聚合分數通過熒光檢測分析Tat對NEP的抑制活性。Tat半胱氨酸豐富結構域通過共價鍵與NEP的活性位點相結合形成二聚體,起到抑制NEP降解Aβ的活性作用。體外研究發現,Tat蛋白可抑制80%NEP活性。將重組Tat直接注入腦培養基中,導致可溶性Aβ增加125%。研究人員又對14例HIV-1感染者和5例年齡相仿的對照者的尸檢腦組織切片進行檢測,結果發現前者腦中Aβ明顯多于后者。進一步的分析顯示,Aβ負荷與HIV-1感染病程明顯相關,而與年齡無關,這就預示著當同齡健康人的腦中僅有少量或尚無Aβ積聚的時候,HIV感染者就可能已經存在極高負荷的Aβ,推測這與Tat抑制NEP的活性有關。為進一步研究Tat與NEP的關系,將Tat蛋白切割成 17個 Tat多肽(每個多肽含15個氨基酸殘基),熒光分析法研究顯示這些多肽中含KCCF氨基酸序列的多肽在抑制NEP方面起主導作用。Daily等[23]通過觀察HIV感染(包括HIV-1血清學陽性)患者腦內 Aβ沉積變化探討Tat抑制NEP的效應,發現源自Tat的半胱氨酸豐富區的多肽可明顯抑制NEP,出現淀粉樣物質沉積。這種抑制作用是競爭性和可逆性的,其抑制的機制目前尚不清楚。有學者認為是Tat的半胱氨酸豐富區與NEP Zn2+結合序列的活性位點通過非共價鍵相結合而抑制NEP的活性。

4 展 望

AD是一種以進行性高級認知功能障礙和記憶功能喪失為特征的疾病[24],其發病率隨年齡增長而增加,65歲以上者約為5%。在AD的發病機制中,Aβ的降解及清除與Aβ形成和沉積具有同等重要作用。維持Aβ正常降解及清除能力的初步研究展示了希望,特別是通過病毒載體介導的NEP基因轉染或細胞移植可上調NEP的活性,明顯減少Aβ的沉積數量及速度,減輕Aβ所致的神經變性損傷,有望成為AD的治療新靶點。但基因轉染后NEP活性的有效持續時間、NEP過度表達后是否對機體帶來不利影響等問題還需要在不同動物尤其在靈長類動物中進行深入研究。

[1]Turner AJ,Isaac RE,Coates D.The neprilysin(NEP)family of zinc metalloendopeptidases:genomics and function[J].Bioessays,2001,28(3):261.

[2]Oefner C,Arcy A,Hennig M,et a1.Structure of human neutral endopeptidase(Neprilysin)complexed with phosphoramidon[J].J Mol Biol,2000,296(2):341.

[3]Iwata N,Higuchi M,Saido TC.Metabolism of amyloidbeta peptide and Alzheimer′s disease[J].Pharmacology Therapeutics,2005,108(2):129.

[4]Huang SM,Mouri A,Kokubo H,et al.Neprilysin-sensitive synapse-associated amyloid-beta peptide oligomers impair neuronal plasticity and cognitive function[J].J Biol Chem,2006,281(26):17941.

[5]Li-Bo ZZ,Mouri A,Iwata N,et al.Inhibition of neprilysin by infusion of thiorphan into the hippocampus causes an accumulation of amyloid Beta and impairment of learning and memory[J].J Pharmacol Exp Ther,2006,317(1):334.

[6]Hemming M L,Patterson M,Reske-Nielsen C,et al.Reducing amyloid plaque burden via ex vivo gene delivery of an Abeta-degradingprotease:anovel therapeutic approach to Alzheimer disease[J].PLos Med,2007,4(8):262.

[7]El-Amouri SS,Zhu H,Yu J,et al.Neprilysin:an enzyme candidate to slow the progression of Alzheimer′s disease[J].Am J Pathol,2008,172(5):1342.

[8]Spencer B,Marr RA,Rockenstein E,et al.Long-term neprilysin gene transfer is associated with reduced levels of intracellular Abeta and behavioral improvement in APP transgenic mice[J].BMC Neurosci,2008,9:109.

[9]Guan H,Liu Y,Daily A,et al.Peripherally expressed neprilysin reduces brain amyloid burden:A novel approach for treating Alzheimer′s disease[J].J Neurosci Res,2009,87(6):1462.

[10]Mohajeri M H,Wolfer DP.Neprilysin deficiency-dependent impairment of cognitive functions in a mouse model of amyloidosis[J].Neurochem Res,2009,34(4):717.

[11]Iwata N,Tsubuki S,Takaki Y,et al.Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin[J].Science,2001,292(5521):1550.

[12]Fukami S,Watanabe K,Iwata N,et a1.Aβ-degrading endopeptidase,neprilysin,in mouse brain:synaptic and axonal localization inversely correlating with Aβpathology[J].Neuroscience Research,2002,43(1):39.

[13]Takeuchi Y,Uetsuka K,Murayama M,et al.Complementary distributions of amyloid-beta and neprilysin in the brains of dogs and cats[J].Vet Pathol,2008,45(4):455.

[14]El-Amouri SS,Zhu H,Yu J,et al.Neprilysin protects neurons against Aβpeptide toxicity[J].Brain Res,2007,1152:191.

[15]朱洪山,晏勇.脂質代謝在阿爾茨海默病發病機制中的研究進展[J].重慶醫學,2009,38(3):347.

[16]Yang L,Hao J,Zhang J,et al.Ginsenoside Rg3 promotes beta-amyloid peptide degradation by enhancing gene expression of neprilysin[J].J Pharm Pharmacol,2009,61(3):375.

[17]Saito T,Iwata N,Tsubuki S,et a1.Somatostatin regulates brain amyloidβ peptide Aβ42 through modulation of proteolytic degradation[J].Nat Med,2005,11(4):434.

[18]Hama E,Saido TC.Etiology of sporadic Alzheimer′s disease:somatostatin,neprilysin,and amyloid beta peptide[J].Med Hypotheses,2005,65(3):498.

[19]Burgos-Ramos E,Hervás-Aguilar A,Aguado-Llera D,et al.Somatostatin and Alzheimer′s disease[J].M ol Cell Endocrinol,2008,286(1):104.

[20]Nalivaeva NN,Fisk L,Kochkina E,et al.Effect of hypoxia/ischemia and hypoxic preconditioning/reperfusion on expression of some amyloid-degrading enzymes[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1035:21.

[21]Fisk L,Nalivaeva NN,Boyle JP,et al.Effects of hypoxia and oxidative stress on expression of neprilysin in human neuroblastoma cells and rat cortical neurones and astrocytes[J].Neurochem Res,2007,32(10):1741.

[22]Rempel HC,Pulliam L.HIV-1 Tat inhibits neprilysin and elevates amyloid beta[J].AIDS,2005,19(2):127.

[23]Daily A,Nath A,Hersh LB.Tat peptides inhibit neprilysin[J].J Neurovirol,2006,12(3):153.

[24]梁敏文,冼英杰,戴耀宗,等.老年癡呆癥患者血漿中鎂鈣濃度變化[J].醫藥論壇雜志,2007,28(23):55.