Nkx2-5轉錄因子在心臟發育中的作用

楊 哲綜述,張 勇審校

（濟南軍區總醫院心外科 250000）

心臟是脊椎動物在胚胎發育過程中第一個形成的器官,脊椎動物的心臟由多細胞系的特化到管狀結構的形成,最后精確組裝為成熟的4個心腔結構,經歷了一個復雜的發育過程,它涉及到多種基因不同時間和不同空間的先后表達與相互作用。研究脊椎動物心肌基因表達的分子調控是了解調節心肌發生的關鍵。Nkx2-5是目前研究較多的與心臟發育密切相關的轉錄因子。

1 Nkx2-5轉錄因子

最初人們應用果蠅同源結構域（homeodomain,HD）寡核苷酸探針篩查果蠅cDNA文庫,克隆出NK型同源盒基因,隨后分離出一種與果蠅背側血管/心臟發育密切相關的果蠅NK-2型基因——tinman基因。當tinman基因發生突變時會導致果蠅心臟形成異常。由于該類基因在進化中的高度保守性,人們猜測是否在脊椎動物體內也存在著這一類基因并且保留著相似的功能。目前已從脊椎動物鑒定出6個結構和功能上與tinman基因相關的基因,即Nkx2-3、Nkx2-5、Nkx2-6、Nkx2-7、Nkx2-8、Nkx2-9。其中Nkx2-5/Csx（cardiac specific homebox）基因正是影響心臟發育的關鍵性的轉錄因子之一[1]。1993年研究人員應用cDNA文庫篩查、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、RT-PCR和原位雜交等分子技術分別在兩棲類和嚙齒類動物體內分離出Nkx2-5基因,并證明其確實與果蠅tinman基因高度同源[2]。Lyons等[3]報道被破壞Nkx2-5基因的小鼠心臟發育異常。Turbay等[4]在成人心臟cDNA文庫中分離出Nkx2-5基因,進一步將其定位于5q35。Schott等[5]證實在人類先天性心臟病患者中確實存在 Nkx2-5基因的突變。

NK-2編碼轉錄激活因子是DNA結合蛋白質,結合位點位于目的基因的啟動子和（或）增強子的共有序列（T[C/T]AAGTG）,它能激活轉錄。它的同源結構域（60個氨基酸）的三維結構是由3個α-螺旋組成,其中螺旋Ⅱ和Ⅲ形成一個螺旋-轉角-螺旋的結構,NK-2同源結構域的C-末端包含17個氨基酸的保守序列,NK-2特異結構域有一個不變的疏水氨基酸中心簇（VPVLV）,它可能在蛋白質與蛋白質的相互影響中起作用,如果這個結構域發生突變,將會影響它在體外結合DNA的能力。Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型成員,是心臟前體細胞分化的最早期標志之一。它主要通過同源盒結構域與目的基因中相應的順式作用元件（NKE）序列（5′-TNAAGTG-3′）結合,作為轉錄因子啟動下游基因的轉錄,在胚胎發育和器官形成中發揮重要作用。Nkx2-5位于人類染色體5q35,具有兩個外顯子。該基因的側翼序列及外顯子之間存在著許多具有重要功能的啟動子、增強子、抑制因子和一些自動調節因子。它們在不同時間和空間調控Nkx2-5基因,使其在心臟及其他器官的發育過程中發揮復雜的調節作用。Nkx2-5基因編碼的蛋白具有4類高度保守的結構域,其中包括N端的TN（tin）結構域、160個氨基酸組成的同源盒結構域（HD）、位于HD下游的NK2-SD和C端含有GI-RAW保守的結構域。其中HD可以與目的基因中相應的啟動子結合,從而促進下游基因的轉錄。對這種蛋白質-DNA結合的最有意義的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸等,除此之外Nkx2-5還有一個富含丙氨酸和脯氨酸殘基的阻遏結構域,以及富含上述兩種氨基酸和天冬氨酸、谷氨酸殘基的激活域。它們的變化將引起蛋白質-DNA間親合力的改變,從而影響基因的轉錄,產生相關蛋白的缺陷,形成心臟畸形[6]。

Nkx2-5基因具有明顯的心臟特異性表達的特點,雖然在發育階段的脾、舌、胃和甲狀腺等組織中Nkx2-5基因也有低度表達,但出生后除心臟外其他器官中Nkx2-5蛋白水平都明顯下降。這說明Nkx2-5在mRNA和蛋白水平上對多種器官的發育都有一定的影響,尤其對心臟發育的作用最為明顯[7]。

Nkx2-5是背側中胚層形成所必需的,它在心肌開始分化前即開始表達,是所有脊椎動物心臟發生中最早表達的轉錄因子,即心臟前體細胞最早的標志物。在心臟發育過程中，Nkx2-5最初見于心臟頭褶期心肌源性前體細胞,持續表達于心肌細胞分化階段,隨后在胚胎、胎兒和成體心肌細胞中保持一定的表達水平。應用 RNA原位標記技術顯示在懷孕后7.5d時Nkx2-5開始表達,主要在心肌發生板的內胚層和中胚層的細胞核中表達[8]。到了成熟階段,Nkx2-5/Csx只在房室肌細胞核中表達。Nkx2-5/Csx基因突變的純合子小鼠胚胎可形成心臟,但不能正常旋轉,且心壁變薄、心功能不全、心臟不完全分隔、不表達心室特異性基因等,胚胎很快死于循環衰竭[7]。

隨著對Nkx2-5基因結構和表達情況的闡明,更多的研究轉向Nkx2-5基因的功能及調節作用機制。大量研究表明，Nkx2-5基因敲除導致胚胎死于心臟畸形,Nkx2-5基因的過度表達也可以引起心臟增大。有資料顯示,Nkx2-5基因位于許多對心臟發育有作用的基因的上游,在Nkx2-5-/-小鼠應用原位雜交技術檢測相關基因,發現anf、mlc2v、mef2c、mhc等基因的表達受到嚴重干擾[9]。同時,Nkx2-5基因也受到多種因素的調節。脊椎動物與果蠅dpp基因相關的基因骨形成蛋白（bone morphogenesis proteins,BM Ps）在胚胎中胚層的形成早期發揮作用,小鼠bmp2缺失,Nkx2-5不表達,心臟早期發育階段停滯[10]。有研究表明,GATA-4和Nkx2-5之間存在相互協調作用,并具有啟動子依賴性,而且復雜的順式調節作用在心肌細胞的基因表達中有重要地位。體外實驗表明,Nkx2-5基因的表達可以啟動心肌的發生,并且在心肌分化過程中激活mef2c基因；而mef2c基因的表達在啟動心肌發生的同時可以上調Nkx2-5、GATA4、α-肌動蛋白和M HC的表達[11]。

2 Nkx2-5與其他轉錄因子之間的相互作用

有研究表明,GATA-4與Nkx2-5能相互作用,彼此是輔助因子。在心肌細胞中兩者相互作用調節心房利鈉因子和α-心肌肌動蛋白啟動子的表達。通過轉基因分析顯示,ANF啟動子有1個Nkx2-5的結合位點,2個GATA-4結合位點,這些結合位點對于ANF的表達是必須的[12]。有研究表明,Nkx2-5和GATA-4轉錄因子可以通過協同作用使內源性α-心肌肌動蛋白 mRNA表達增高 100倍[13]。它們的交互作用是通過Nkx2-5的同源區域的螺旋Ⅲ和GATA-4的C-終端鋅指區域之間的相互作用實現的。在異源細胞中共同表達GATA-4和Nkx2-5導致協同激動ANF的啟動子。這個協同作用包括在離體和在體上的GATA-4和Nkx2-5相互作用。結構/功能分析說明GATA-4結合到Nkx2-5可以導致Nkx2-5激動區域的結構改變,這種作用可以在早期心肌形成關鍵路徑中提供協同的交叉作用[14]。

GATA-4因子也能調節Nkx2-5在心肌發育時的表達,提示在心肌中Nkx2-5和GATA轉錄因子之間存在一個相互增強的轉錄調節循環通路。在早期心臟形成中,GATA-4在心臟譜系與Nkx2-5共表達,GATA-4和Nkx2-5互相依賴共同發揮作用,在Nkx2-5的遠端增強子含有限制性心臟鋅指轉錄因子GA TA-4的高親和性結合位點,Nkx2-5的心臟特異性上游增強子在線性心管和環化的過程中處于活化狀態[15]。

綜上所述,組織特異性Nkx2-5同源核蛋白是心肌細胞前體最早的標記,是心臟形成的關鍵,但不能發起心臟的形成。它在心臟發育過程中與其他的轉錄因子起著互相協同的作用,一起調節心肌特異基因的表達。過度表達Nkx2-5可以促進前體心肌細胞的發育。

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