雙重染色標記胃癌前哨淋巴結的臨床應用研究

劉 飛,程 翔

(湖北省荊門市石化醫院 448000)

前哨淋巴結活檢(sentinel lymph node biopsy,SLNB)最早于1977年Cabanas[1]在研究陰莖癌時觀察到了陰莖癌SLN的存在,現廣泛運用于乳腺癌和黑色素瘤等惡性腫瘤,其預測腫瘤周圍淋巴結狀態的準確性超過 95.0%,假陰性率低于5.0%[2-3],但對胃癌的適用性和可行性尚有爭議。程黎陽等[4]應用生物染料和核素聯合示蹤法使SLNB的假陰性率降至6.0%,但聯合示蹤法有放射性污染且設備昂貴,不易普及。因此,有必要尋找一種廉價、簡便的方法。馮虎翼和高根五[5]應用多重染料示蹤腋窩前哨淋巴結取得了良好的效果。本研究意在通過應用雙重染料標記方法評估前哨淋巴結預測胃癌區域淋巴結轉移狀態的價值及其指導胃癌淋巴結清掃范圍的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年 2月至 2009年2月在本院治療的胃癌患者32例。術前均行電子胃鏡檢查,病理證實為胃癌。所有病例術前未發現遠處轉移。全部病例均行標準胃癌根治術(胃癌切除+D2式區域淋巴結清掃術)。32例胃癌患者詳細病理資料:(1)腫瘤部位:U為3例,M為4例,L為25例;(2)腫瘤大小:直徑范圍0.6～6.5 cm,平均直徑 3.9 cm;(3)腫瘤浸潤深度:T1為5例,T2為16例,T3為11例;(4)腫瘤分化程度:高分化3例,中分化16例,低分化13例。

1.2 材料 專利藍C27H31N2NaO6S2分子量為566.66(美國Sigma公司產品)配制滅菌并分裝成2%的溶液備用,吲哚菁綠C43H47N2NaO6S2分子量為774.96(沈陽濟世制藥有限公司25 mg/支)。免疫組化染色試劑盒,濃縮型DAB試劑盒,鼠抗人癌胚抗原(CEA)單克隆抗體,鼠抗人細胞角蛋白20(CK20)單克隆抗體(上海水源生物有限公司)。

1.3 SLN標記及檢出方法 開腹后,對符合研究條件者,于原發腫瘤灶周圍的正常胃壁選取對稱的 2、4、6、8、10、12點共6個點,用連接7號針頭的5 mL注射器抽取專利藍和吲哚菁綠分別注射于2、6、10和4、8、12點處漿膜下0.8 mL,注射后數秒即可見到染料沿著淋巴管向遠處延伸(見彩插Ⅱ圖1),3～5 min后待染色淋巴結(見彩插Ⅱ圖2)即SLN出現,剝離、切除之,10%福爾馬林溶液固定,同時標注其所屬的組別、站數。術畢沿大彎側縱行剖開胃腔,明確并記錄癌腫的確切部位、大小等,查找、切除遺留下的未藍染淋巴結(nSLN),標注其所屬的組別、站數,并確認染料未注入胃腔內。

1.4 手術方法 所有患者行標準根治性胃切除術(胃癌切除+D2式區域淋巴結清掃術)。

1.5 病理檢查 將所有淋巴結和大體標本送本院病理科行常規HE染色檢查、CEA和CK20 IHC染色檢查。(具體操作步驟嚴格按照試劑說明書執行)。

1.6 結果判斷 免疫組織化學(IHC)染色陽性判斷標準:將細胞漿或胞核中出現明顯棕黃色顆粒的細胞定義為陽性細胞,含有這類細胞的淋巴結即定為陽性淋巴結(癌轉移淋巴結)。HE染色檢測陰性而IHC染色檢測陽性的淋巴結均視為微轉移(micrometastasis,MM)(見彩插Ⅱ圖3、4)。每張切片由2名病理醫師分別進行判斷。

1.7 統計學方法 以檢出率、敏感性、準確性、假陰性率等作為胃癌SLN檢測結果的評價指標,各指標定義參照文獻[6],研究數據行χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統計學意義。使用SPSS13.0軟件包進行數據統計。

2 結 果

2.1 SLN檢出結果 32例中共有31例找到SLN,檢出率為96.9%(31/32),其中專利藍檢出26例,檢出率為81.3%(26/32),吲哚菁綠檢出25例,檢出率為 75.8%(25/32)。31例患者共檢出SLN 130枚,檢出范圍1～11枚/例,平均4.2枚/例;其中同時被專利藍和吲哚菁綠標記SLN占105枚,僅被專利藍標記的SLN占17枚,僅被吲哚菁綠標記SLN 8枚,合計占19.2%(25/130);術后收集nSLN共獲得414枚,平均12.8枚/例。

2.2 SLN的分布 在31例檢出SLN的患者中僅在N1者16例,僅在N2者2例,同時在 N1和 N2者10例,同時在 N1+N2+N3者3例,胃癌SLN大部分分布在臨近病灶的胃周圍(N1)51.6%(16/31),但也有總數達6.5%(2/31)的首先轉移的淋巴結僅發生在遠離胃癌病灶的N2或N3區域,可將其視為胃癌淋巴結的“跳躍性”轉移。

2.3 HE染色檢查 SLN轉移率為35.3%(46/130),非SLN轉移率為7.0%(29/414),兩者轉移率相比差異有統計學意義(χ2=67.03,P＜0.05)。31例被雙重染色標記的病例中有 21例SLN存在轉移,其中18例非前哨淋巴結(nSLN)亦存在轉移,3例SLN為胃周淋巴結惟一轉移部位。有10例SLN無轉移,其中1例nSLN存在轉移。SLN預測胃周淋巴結轉移情況的敏感性為95.5%(21/22),假陰性率為4.55%(1/22),準確率為96.8%(30/31);當僅計算專利藍標記SLN預測胃周淋巴結轉移情況的假陰性率為18.18%(4/22),當僅計算吲哚菁綠標記SLN預測胃周淋巴結轉移情況的假陰性率為22.72%(5/22)。3種染色標記的假陰性率結果比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 免疫組織化學(IHC)染色檢查 HE染色檢查SLN無轉移的10例患者中有3例IHC檢查證實為微轉移,544枚淋巴結中HE染色檢查無轉移的469枚淋巴結中有39枚證實為轉移陽性,其中SLN 15枚,nSLN 24枚,其中雙重染色標記的SLN有10枚,專利藍標記的SLN有2枚,吲哚菁綠標記的SLN有3枚。使用IHC染色檢查胃癌SLN淋巴結的轉移個數及轉移度均高于常規HE染色,但兩種病理檢查結果比較差異有統計學意義(χ2=32.38,P＜0.05)。

3 討 論

前哨淋巴結活檢術(sentinel lymph node biopsy,SLNB)是近十多年來發展起來的一種外科技術,其在黑色素瘤和乳腺癌中已被廣泛應用于臨床實踐[7-8]。但是人們對于SLNB應用于胃癌的治療一直存在懷疑,主要是因為胃癌的淋巴結轉移較乳腺癌、黑色素瘤有其特殊性,胃的淋巴結引流是多向性的,包括胃大小彎、賁門左右和幽門上下組淋巴結的引流,因此,胃癌SLN檢測應以實際的SLN顯影結果為依據,其數量有可能超過1個,出現多個是可以接受的。國外已有文獻[9]報道胃癌SLNB檢出的準確率達96%～100%,并在檢測中發現的前哨淋巴結的位置,絕大多數屬于第 1站淋巴結,很少位于第 2、3站淋巴結。符合胃的淋巴結引流一般規律,即首先到達第1站,然后到達第2、3站。本研究結果顯示:胃癌SLN絕大多數分布于病灶附近的淋巴結群,即以 No.3、No.4、No.6、No.5、No.l和 No.2最多見,占89.2%(116/130),與文獻報道相近[10-12]。轉移的SLN也大部分分布在病灶附近的淋巴結群。由此可認為:同黑色素瘤和乳腺癌一樣,胃的淋巴結引流同樣具有有序性,胃癌的淋巴轉移同樣遵循由近及遠的規律。

實施SLNB的前提是找到真正的SLN,目前常用的技術有染料法、同位素法以及二者聯合應用的方法。程黎陽等[4]作了比較研究后認為,核素和核素聯合染料較單獨使用染料法有更高的成功率。但是核素法存在需要特殊設備、操作復雜、術中存在安全隱患、術后處理環節復雜等缺點,不易推廣應用。單獨使用一種生物染料檢測胃癌SLN的假陰性率較高[13],達11.4%～13.3%,這是臨床應用所不能接受的。本實驗應用專利藍和吲哚菁綠雙重染料聯合示蹤法用于胃癌的前哨淋巴結活檢。32例患者中,有31例通過跟蹤染色的淋巴管找到了染色的淋巴結。因此,雙重染料聯合示蹤法用于胃癌的前哨淋巴結是一種更簡單、更經濟同時滿足臨床要求一種方法。

SLNB的主要目的是通過SLN組織學狀態預測整個區域淋巴結轉移狀況,準確判定SLN的轉移狀態是SLNB準確預測淋巴結轉移狀態的一個關鍵,從而指導臨床治療和預后判斷。但常規HE染色有其局限性。約有9.0%～31.0%的淋巴結微轉移(MM)不能被檢出[14]。因此,本文結合細胞角蛋白(CK-20、CEA)免疫組化染色的方法對獲得的淋巴結進行檢查。在本實驗中:常規HE染色檢查130枚中有46枚SLN存在轉移,有84枚SLN無轉移。而IHC檢查證實常規HE染色檢查SLN無轉移的84枚患者中有15枚為轉移陽性及微轉移(MM),使SLN的轉移率提升了11.5%。這其中包含1例常規HE染色nSLN陽性而SLN陰性的患者,通過IHC染色檢查,從而減低了SLNB的假陰性率。國外近期的研究報道同樣支持了這一觀點[15]。本實驗使用IHC染色檢查胃癌SLN淋巴結的轉移個數及轉移度均高于常規HE染色,但2種病理檢查結果比較差異有統計學意義(χ2=32.38,P＜0.05)。

SLN組織學狀態預測胃癌區域淋巴結轉移狀況的可靠性十分重要,這也是決定SLNB能否在胃癌外科推廣應用的關鍵因素之一。準確率和假陰性率是評價SLN預測區域淋巴結轉移狀況可靠性的2個重要指標。本研究中32例患者中有31例成功檢出SLN,真陽性為21例,真陰性為9例,由SLN組織學狀態預測胃癌區域淋巴結轉移狀況的準確率為96.8%(30/31);成功檢出SLN的 31例患者中,有1例呈現出假陰性,由SLN預測胃癌區域淋巴結轉移狀況的假陰性率為4.55%(1/22),低于5%,達到了臨床上普遍可以接受的標準。

總之,通過胃癌前哨淋巴結檢測預測胃癌區域淋巴結轉移情況的方法是切實可行的。但還有許多問題有待解決,例如規范化的染料注射,染料注射劑量,哪幾種染料聯用假陰性率最低等。本研究由于病例數較少,還有待于大規模多中心臨床隨機對照實驗和對胃癌生物學特性的進一步認識,以確認該技術在胃癌治療上的臨床應用價值。

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