腦外傷后小鼠海馬區notch信號的表達變化

潘長福 ，阮瓊芳 ，沈曉黎 ，涂 偉 ，婁遠蕾 ，匡助才 ，賴賢良 ，汪 泱 ，鄧志鋒*

(1、南昌大學第二附屬醫院神經外科；2、南昌大學泌尿外科研究所；3、南昌大學研究生院醫學部，江西 南昌 30006)

腦外傷是一種常見的致死、致殘性疾病，隨著現代交通工具的發展，其發病率呈現逐年上升的趨勢。人類海馬區神經元與學習記憶緊密相關，但該區神經元對腦外傷極為敏感，傷后神經元大量變性壞死，導致患者學習記憶功能障礙[1]。近年來研究發現，成年哺乳動物海馬齒狀回亞顆粒區(subgranular zone，SGZ)存在神經干細胞(neural stem cells，NSCs)，這些細胞在腦外傷后被激活，增殖分化成功能上成熟的神經元，整合到神經網絡中，一定程度上能促進患者神經功能的恢復[1]。但是腦外傷后NSCs增殖分化能力十分有限，遠不能達到臨床恢復的要求。因此，如何最大程度地提高神經干細胞增殖分化能力是治療腦外傷的關鍵。近年來研究證實，notch信號表達在成體海馬區神經干細胞中，在其增殖分化調控機制中起著極其重要的作用[2]。然而notch信號是否也調控腦外傷后神經干細胞增殖、分化過程，目前并不清楚。本研究擬通過自由落體法復制閉合性腦外傷小鼠模型，從基因水平上觀察腦外傷后海馬區notch信號的表達變化，初步探討該信號與內源性神經干細胞增殖、分化的關系，為以后進一步深入研究notch信號調控成體神經再生機制提供理論基礎。

材料與方法

1 實驗動物分組及模型制備 Balb/c系雄性小鼠，體重23g左右，購自南昌大學醫學院動物實驗中心。隨機分為假手術(sham)組、腦外傷4h、1d、3d模型組，每組分別3只動物。參考文獻，采用改良的自由落體法復制閉合性腦外傷小鼠模型[3]。打擊裝置由腦立體定向儀、垂直導管、下落砝碼、頂端涂有聚乙烯的撞針組成，撞針底端直徑3mm(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司提供)。異氟烷吸入麻醉小鼠后，將頭部固定于腦立體定向儀上，消毒，沿中線切開頭皮，暴露頭蓋骨，分離骨膜，將撞針置于前、后囟門中點偏左1mm。以40g砝碼從25cm高處沿垂直導管自由下落，撞擊撞針造成腦損傷，縫合頭皮，給以充足水和食物喂養。假手術對照組僅切開頭皮，暴露顱骨，不實施打擊。傷后1h根據NSS評分系統(表1)評分[4]，篩選7～8分重度腦外傷小鼠納入實驗研究對象。

表1 小鼠腦損傷NSS評分系統

2 組織標本制備 腦外傷組分別在傷后4h、1d、3d處死動物，顯微鏡下迅速分離傷側海馬組織，-80℃保存，以備提取總RNA。

3總RNA抽提 收集組織標本，按Trizol試劑說明書提取總RNA。所提總RNA行紫外分光光度計檢測A260/A280在1.8～2.0之間，并計算濃度，-80℃保存備用。

4實時定量RT-PCR (real-time PCR)檢測notch1、hes1mRNA 表達 取 1μg總 RNA，使用 Fermentas逆轉錄試劑盒，隨機引物逆轉錄合成cDNA。按以下體系進行Real-time PCR反應：cDNA模板1μl，2×PCR mix 10μl，2μmol/L 上下游引物各 1μl，0.5μL 10×SYBR GreenI，加無菌水至 20μl，不加模板為陰性對照。將反應管置于ABI 7500 real-time PCR system中進行擴增反應。反應條件如下：95℃，10min；95℃ ，15sec，60℃ 30sec 72℃ 30s for 40cycles；72℃10min。以GAPDH為內參，假手術組海馬組織為對照組，用2-ΔΔCt值表示基因的相對表達量。Notch1 上 游 引 物 ：5＇-CCTTGGGTTCATGGATTAGTTTTG-3＇， 下 游 引 物 ：5＇-CTCAGTTGGATTTGGATGATGCT-3＇。 Hes1 上 游 引 物 ：5＇-TACCCCAGCCAGTGTCAACAC-3＇， 下游引物：5＇-TTTCCAGAATGTCTGCCTTCTCTA-3＇。

5統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。所得數據均以±s表示，進行單因素方差分析。P＜0.05為有統計學意義。

結 果

腦外傷后傷側海馬notch1和hes1 mRNA的表達變化

Real-time PCR結果顯示，腦外傷后notch1基因在傷后4h即開始升高，1d時達到高峰，較對照組升高約6倍，3d時有所回落，但仍維持在高水平，較對照組升高2倍；而hes1基因在傷后4h表達無明顯變化，1d時明顯升高，較對照組升高3倍，3d時則回落到正常水平，如圖1所示。

圖1 腦外傷后motch1、hes1 mRNA的表達

討 論

人類海馬區神經元與學習記憶緊密相關，但該區神經元對腦外傷極為敏感，傷后大量神經元變性壞死，導致患者學習記憶功能障礙，可作為評價腦損傷嚴重程度的重要指標之一[1]。目前研究證實，成體哺乳動物海馬齒狀回亞顆粒區存在內源性神經干細胞，后者是一類能自我更新，具有分化成神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞能力的細胞群。這些細胞在腦外傷后被激活，增殖分化成功能上成熟的神經元，并整合到海馬回路中，促進患者學習記憶功能改善[1]。

Notch信號通路為調控細胞命運的基本通路[5]。在腦的發育過程中，notch信號在神經干細胞增殖、分化過程中起著極為關鍵的作用[6,7]。激活notch信號，可維持神經干細胞的未分化狀態[7,8]，促進其自我增殖[9]。最近研究表明，notch信號也在成年哺乳動物海馬區和室下區表達，在成體神經再生過程中發揮著類似的調控作用[2]。Notch1為一種跨膜受體，當其與鄰近細胞上的配體結合時，notch信號被激活，在γ-分泌酶的作用下，notch1釋放出notch胞內區域段(Notch intracellular domain，NICD)，后者轉移至胞核內，與DNA結合蛋白RBP-J/CSL結合，激活下游轉錄抑制因子hes1，從而發揮notch1介導的調控作用[10]。

本研究結果發現，腦外傷后海馬區notch1 mRNA在傷后早期即開始升高，3d時仍維持在較高水平，hes1mRNA也在傷后早期升高1d，提示腦外傷可激活notch信號。而Sun、Urrea等[11-12]研究表明，腦外傷后海馬齒狀回內神經干細胞增殖在傷后早期即開始增殖，于2～3d時達到高峰，與傷后notch信號表達呈現時間上相一致的表達趨勢。由此可以推測，腦外傷后notch信號表達水平的升高可能與神經干細胞增殖分化相關。因此進一步全面深入研究notch信號調控腦外傷后成體神經干細胞增殖、分化機制，可為將來臨床治療提供新的可能靶點,具有十分重要的意義。

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