IFN-γ上調(diào)MHC-Ⅱ分子表達(dá)對(duì)KC免疫原性的影響

宋仁剛 宋任強(qiáng) 柳大烈

IFN-γ上調(diào)MHC-Ⅱ分子表達(dá)對(duì)KC免疫原性的影響

宋仁剛 宋任強(qiáng) 柳大烈

目的觀察在炎癥因子IFN-γ的作用下，角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte，KC）免疫原性的變化情況。方法KC體外傳代培養(yǎng)，按不同的INF-γ濃度分組后作用于傳代的KC。將高表達(dá)MHC-Ⅱ分子的KC與異體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后，觀察淋巴細(xì)胞的增殖情況；同時(shí)，將KC植入異體小鼠皮下，觀察免疫排斥跡象。結(jié)果在6 000 U/mL IFN-γ的作用下，MHC-Ⅱ＋的KC超過(guò)90%。高表達(dá)MHC-Ⅱ分子的傳代KC無(wú)明顯刺激異體淋巴細(xì)胞增殖的作用，植入異體小鼠皮下后也無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。結(jié)論傳代后的KC在IFN-γ作用下高表達(dá)MHC-Ⅱ分子，表達(dá)MHC-Ⅱ分子的KC無(wú)明顯免疫原性。

干擾素-γ主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ角質(zhì)形成細(xì)胞免疫原性

組織工程化皮膚是目前治療難治性潰瘍、大面積燒傷等皮膚缺損性疾病最具前景的方法之一。但是，以異體皮膚細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化皮膚，移植后是否引起免疫排斥反應(yīng)，卻一直存在爭(zhēng)議[1－3]。目前主要使用角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte，KC）、成纖維細(xì)胞等作為種子細(xì)胞來(lái)構(gòu)建組織工程化皮膚。正常情況下KC表面僅表達(dá)MHC-Ⅰ類抗原，不表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原及共刺激分子，本身不具備抗原遞呈能力。但有實(shí)驗(yàn)顯示，在炎癥因子（如IFN-γ）的作用下，KC能誘導(dǎo)MHC-Ⅱ的表達(dá)。MHC-Ⅱ是專職抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC）呈遞抗原的重要結(jié)構(gòu)之一[4]。因此，KC能否成為APC，從而激活T細(xì)胞需要實(shí)驗(yàn)證明。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)炎癥狀態(tài)下，用IFN-γ作用KC，觀察MHC-Ⅱ分子表達(dá)情況，隨即將表達(dá)MHC-Ⅱ分子的KC與異體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察淋巴細(xì)胞的增殖程度，并將表達(dá)MHC-Ⅱ分子的KC植入異體小鼠皮下組織，觀察是否發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性6～8周齡BALB/c小鼠30只，體重20～25 g，隨機(jī)平均分為3組。取皮組：小鼠背部常規(guī)消毒后，手術(shù)刀取約1 cm×1 cm的全層皮膚組織，培養(yǎng)表皮細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：將培養(yǎng)的含有1×105個(gè)KC的培養(yǎng)基0.5 mL注入小鼠腹部皮下組織；對(duì)照組：將單純培養(yǎng)基0.5 mL注入小鼠腹部皮下組織。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠KC：小鼠皮膚標(biāo)本加入0.25%Dispase（Sigma公司）浸沒，消化16～18 h，眼科鑷揭下表皮，加0.25%胰蛋白酶消化30 min，用吸管小心反復(fù)吹打，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）重懸，按1×106cells/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞約80%融合后，加0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合消化液消化后傳代，細(xì)胞培養(yǎng)至第2代用于實(shí)驗(yàn)。

小鼠脾淋巴細(xì)胞：對(duì)照組小鼠處死后取脾臟，反復(fù)剪碎后，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離（天津TBD公司），培養(yǎng)2 h后取懸浮細(xì)胞即淋巴細(xì)胞RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 IFN-γ誘導(dǎo)MHC-Ⅱ分子的表達(dá)

配制含1×106U/mL IFN-γ（Sigma公司）的DMED培養(yǎng)基。以1×106cells/mL濃度接種第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KC于24孔板中，培養(yǎng)6 h后給藥，各孔藥物終濃度分別為1 000 U/mL、2 000 U/mL、4 000 U/mL、6 000 U/mL、8 000 U/mL、10 000 U/mL，設(shè)不含IFN-γ的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。部分細(xì)胞采用爬片法培養(yǎng)，擬行細(xì)胞免疫組化染色，方法如下：4%多聚甲醛/PBS固定，0.1%Triton X-100處理5 min，3%H2O25 min，正常山羊血清室溫封閉10 min，加大鼠抗小鼠MHC-Ⅱ（I-A/I-E）單抗（天津三箭公司）4℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記山羊抗大鼠二抗(二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉公司)37℃孵育10 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液37℃孵育10 min，DAB顯色5 min，沖洗后封片，顯微鏡下觀察。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHC－Ⅱ分子的表達(dá)

第2代KC經(jīng)IFN-γ處理后，100 μL PBS重懸1×105個(gè)細(xì)胞，加FITC-抗小鼠MHC－Ⅱ（I-A/I-E）抗體，同型對(duì)照管中加入FITC-大鼠IgG2b（eBioscience公司），4℃放置30 min，PBS 2 000 r/min洗滌，重懸于0.4 mL PBS中，流式細(xì)胞儀（Beckman公司）分析。

1.5 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

分別將原代和第2代KC以1×102個(gè)、1×103個(gè)、1×104個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，經(jīng)8 000U/mL IFNγ培養(yǎng)48 h后，加入含25 μg/mL絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞45 min，吸出培養(yǎng)基后各孔分別加入1×105個(gè)淋巴細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。其余步驟按BrdU-ELISA試劑盒（Roch）說(shuō)明書進(jìn)行，即：各孔加10 μL BrdU孵育2 h；離心后加入200 μL固定液，室溫下30 min；甩干固定液后加100 μL anti-BrdU-POD工作液，室溫孵育90 min；反復(fù)沖洗3遍后加100 μL底物液，室溫下10 min；分光光度計(jì)在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。設(shè)5 μg/ mL PHA處理的第2代KC為陽(yáng)性對(duì)照，不經(jīng)IFNγ處理的第2代KC為陰性對(duì)照，RPMI 1640培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.6 小鼠體內(nèi)觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

腹部皮下植入KC 2周后，處死實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠。取小鼠注入細(xì)胞處皮膚全層組織，中性福爾馬林固定，行HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色，鹽酸乙醇分色，淡氨水藍(lán)化，伊紅染色，系列乙醇脫水，入二甲苯，中性樹膠封片；免疫組化：石蠟切片脫蠟，其余步驟同前述。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

剛分離的小鼠KC呈圓形，活力較好，活細(xì)胞數(shù)均超過(guò)80%。2 h后細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞逐漸連接成片，似鋪路石樣生長(zhǎng)。一個(gè)小鼠脾臟能分離約1×107個(gè)淋巴細(xì)胞。分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞鏡下觀察為圓形，呈懸浮生長(zhǎng)。細(xì)胞活力好，活細(xì)胞數(shù)均超過(guò)90%。

2.2 流式細(xì)胞儀分析

隨著INF-γ濃度的增高，KC的MHC-Ⅱ表達(dá)逐漸增高（圖1）。IFN-γ為1 000 U/mL時(shí)MHC-Ⅱ表達(dá)即明顯增高；IFN-γ為6 000～10 000 U/mL時(shí)，MHC-Ⅱ達(dá)到峰值（IFN-γ在6 000 U/mL、8 000 U/mL和10 000 U/mL時(shí)無(wú)顯著差異，P＞0.05）（圖2）。

圖1 小鼠KC MHC-Ⅱ在IFN-γ處理后的表達(dá)

圖2 MHC-Ⅱ的表達(dá)趨勢(shì)

2.3 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

在不同KC刺激下，增殖的淋巴細(xì)胞吸光度不同。原代KC刺激淋巴細(xì)胞增殖非常顯著（與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＞0.05)，且淋巴細(xì)胞增殖程度隨刺激細(xì)胞數(shù)量增多而增高。第2代KC無(wú)明顯刺激淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)（與陰性對(duì)照組比較，P＞0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05）（圖3）。

圖3 異體淋巴細(xì)胞增殖吸光度

2.4 組織學(xué)及免疫組化檢測(cè)

免疫組化染色顯示第2代KC的MHC-Ⅱ分子表達(dá)于細(xì)胞膜（圖4）。經(jīng)不同濃度的IFN-γ處理后KC均明顯表達(dá)MHC-Ⅱ分子，且隨IFN-γ濃度增高，MHC-Ⅱ分子表達(dá)加強(qiáng)。

圖4 KC在IFN-γ的作用下表達(dá)MHC-Ⅱ分子（IH，400×）

植入小鼠KC 2周后，HE染色清晰可見小鼠皮下隆起的KC團(tuán)塊（圖5），與周圍組織區(qū)別明顯。原代KC團(tuán)周圍及其細(xì)胞間可見較多單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，第2代KC團(tuán)未見單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)；原代KC團(tuán)浸潤(rùn)的細(xì)胞免疫組化染色顯示CD3、CD4陽(yáng)性，CD8未見陽(yáng)性染色（圖6）；第2代KC免疫組化染色未見CD3、CD4和CD8陽(yáng)性細(xì)胞。

圖5 植入小鼠皮下的異體KC(HE，100×)

圖6 植入小鼠皮下的異體KC中含有浸潤(rùn)的CD3＋細(xì)胞（IH，100×）

3 討論

大面積燒傷、慢性皮膚潰瘍等皮膚缺損性疾病一直是臨床治療的難題。組織工程基本原理是將體外培養(yǎng)的細(xì)胞與生物材料結(jié)合，移植到病損部位，種植的細(xì)胞增殖分化形成具有功能的活性組織。商品化的組織工程皮膚產(chǎn)品均采用異體細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建，但異體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，與細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)建組織工程皮膚后，是否引起免疫排斥，一直存在爭(zhēng)議。

KC是皮膚的重要的結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，正常情況下其表面僅表達(dá)MHC-Ⅰ類抗原，不表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原及共刺激分子，本身不具備抗原遞呈能力。但在體外培養(yǎng)條件下，KC經(jīng)純化結(jié)核菌素刺激后，能表達(dá)MHC-Ⅱ分子。某些異常情況下，如銀屑病皮損、尖銳濕疣皮損中，KC高表達(dá)MHC-Ⅱ分子，并且與疾病活動(dòng)密切相關(guān)[5]。另外，IFN-γ也能誘導(dǎo)KC表達(dá)MHC-Ⅱ分子。IFN-γ主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，在抗原、PHA或ConA刺激下，T細(xì)胞分泌IFN-γ，通常與IL-2的產(chǎn)生相一致。IFN-γ能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)MHCⅡ類抗原，使其參與抗原遞呈和特異性免疫的識(shí)別過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中加入IFN-γ后，KC均表達(dá)MHC-Ⅱ分子，表達(dá)的MHC-Ⅱ分子位于細(xì)胞膜。隨著IFN-γ的濃度增高，MHC-Ⅱ分子的表達(dá)量也逐漸增高。當(dāng)IFN-γ為6 000 U/mL時(shí)，MHC-Ⅱ分子的表達(dá)量達(dá)到峰值，超過(guò)90%的細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ分子。

MHC-Ⅱ分子抗原，是抗原遞呈細(xì)胞和單核細(xì)胞表面糖基化的跨膜蛋白，表達(dá)MHC-Ⅱ分子對(duì)于向CD4 T細(xì)胞遞呈肽段，啟動(dòng)特異性免疫反應(yīng)非常必要。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為MHC-Ⅱ（+）的KC有可能成為非專職的APC，直接激活T細(xì)胞或可攝取和降解抗原向T細(xì)胞呈遞抗原[6]。我們將不同比例的KC與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：原代KC和PHA能明顯刺激淋巴細(xì)胞増殖。經(jīng)過(guò)IFN-γ處理后，第2代KC在不同比例下均未能有效刺激淋巴細(xì)胞増殖。原代KC能刺激淋巴細(xì)胞增殖，可能與其中混雜的細(xì)胞有關(guān)。表皮中除KC外，還有朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells，LC）、黑色素細(xì)胞等多種細(xì)胞。LC是表皮中專職APC，表達(dá)MHC-Ⅱ抗原及共刺激分子。有實(shí)驗(yàn)證明皮膚中刺激異源性T細(xì)胞反應(yīng)并啟動(dòng)移植物排斥反應(yīng)的是LC。同種異體皮膚移植物是否被排斥與移植物內(nèi)的LC密度相關(guān)，密度越高，越易被排斥，清除供體皮膚的LC將延長(zhǎng)同種異體移植物的存活時(shí)間[7]。KC經(jīng)傳代后去除混雜細(xì)胞尤其是LC，是降低其免疫原性的主要原因。經(jīng)IFN-γ處理的第2代KC高表達(dá)MHC-Ⅱ，但未能明顯刺激淋巴細(xì)胞增殖，提示表達(dá)MHC-Ⅱ并不是KC刺激淋巴細(xì)胞增殖的前提條件。同樣，有研究者認(rèn)為在某些特殊的炎癥條件下，KC高表達(dá)MHC-Ⅱ分子可能是炎癥后的繼發(fā)反應(yīng)，而不是KC作為APC向T細(xì)胞遞呈抗原的標(biāo)志[8]。KC表達(dá)MHC-Ⅱ可能更利于其在炎癥情況下易于分泌前炎癥細(xì)胞因子，從而參與炎癥反應(yīng)[9]。

T細(xì)胞活化必須有雙信號(hào)介導(dǎo)：第一信號(hào)是指T細(xì)胞表面受體與APC上MHC-抗原肽間的相互識(shí)別；第二信號(hào)是來(lái)自APC上的共刺激分子，其中CD80、CD86是目前研究最多的兩個(gè)共刺激分子[10]。我們的實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞儀未檢測(cè)到第2代KC表達(dá)CD80、CD86，雖然有實(shí)驗(yàn)顯示小鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)CD80[1]，但KC在分化過(guò)程中是否表達(dá)共刺激分子，目前仍無(wú)定論。有研究表明，KC能向幼稚CD4 T細(xì)胞遞呈抗原，但因缺乏共刺激分子，遞呈的抗原可能導(dǎo)致T細(xì)胞的失活而不是激活。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使小鼠KC表達(dá)CD80，同時(shí)給予IFN-γ，KC表達(dá)MHC-Ⅱ分子。表達(dá)CD80和MHC-Ⅱ的KC雖然能刺激異體T細(xì)胞增殖反應(yīng)，但反應(yīng)明顯弱于專職APC（如單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）引起的刺激反應(yīng)，提示非專職APC即使表達(dá)共刺激因子還不足以觸發(fā)免疫反應(yīng)，僅能擴(kuò)大宿主的免疫反應(yīng)[11]。

異體皮膚細(xì)胞移植后的轉(zhuǎn)歸目前還存在爭(zhēng)論。有學(xué)者認(rèn)為，異體表皮細(xì)胞移植后，最終將被宿主的免疫系統(tǒng)逐漸排斥，取而代之的是自體細(xì)胞。另有學(xué)者認(rèn)為，移植的異體細(xì)胞能夠長(zhǎng)期存活。在實(shí)驗(yàn)中我們將原代KC、經(jīng)過(guò)IFN-γ處理和不經(jīng)過(guò)IFN-γ處理的第2代KC植入異體小鼠皮下。不同時(shí)間活檢發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，原代KC周圍單個(gè)核細(xì)胞逐漸增多，免疫組化染色顯示浸潤(rùn)的細(xì)胞CD3陽(yáng)性，提示浸潤(rùn)的細(xì)胞主要以T淋巴細(xì)胞為主。相反，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)IFN-γ處理，第2代KC周圍均未見明顯的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化染色未見CD3染色陽(yáng)性細(xì)胞。上述結(jié)果提示：原代KC引起淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的原因可能與混雜的免疫原性較強(qiáng)細(xì)胞有關(guān)；KC僅表達(dá)MHC-Ⅱ分子還不足以趨化淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。深入研究組織工程化皮膚Apligraf移植后的臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Apligraf不含LC、真皮樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞，臨床試驗(yàn)顯示移植Apligraf類似于移植自體皮膚，可以很好地愈合傷口并且迅速在其內(nèi)部生成血管，其形態(tài)、生化及代謝特征與人體皮膚相仿，幾乎無(wú)免疫原性，也未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[12]。Phillips等[13]在研究Apligraf治療下肢靜脈潰瘍的安全性和免疫學(xué)影響時(shí)也證實(shí)了上述觀點(diǎn)，研究中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥征象，也未檢測(cè)出對(duì)KC異體抗原產(chǎn)生應(yīng)答。Guerret等[14]將Apligraf移植于裸鼠，1年后用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)了存活的異體KC，上述證據(jù)進(jìn)一步支持移植異體KC不存在排斥反應(yīng)或排斥反應(yīng)較弱。

綜上所述，異體KC經(jīng)體外傳代培養(yǎng)后，去除了免疫原性較強(qiáng)的細(xì)胞。KC本身免疫原性較弱，不表達(dá)共刺激分子，雖然在炎癥因子IFN-γ的作用下能表達(dá)MHC-Ⅱ分子，但仍無(wú)刺激異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，傳代后的KC免疫原性較低，不是趨化淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的主要原因。本實(shí)驗(yàn)初步證明了傳代后的KC免疫原性較低，為組織工程化皮膚的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)支持。但體內(nèi)免疫反應(yīng)非常復(fù)雜，多種因素參與其中，包括各種細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞與基質(zhì)間的作用以及多種炎癥因子和細(xì)胞因子的作用，都不同程度地影響著免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局。移植的異體細(xì)胞最終轉(zhuǎn)歸如何，仍需更長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀察。

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The Effect of IFN-γ Increasing MHC-ⅡExpressing to the Immunogenicity of Keratinocytes

SONG Rengang1, SONG Renqiang2,LIU Dalie3.
1 Department of Plastic Surgery,Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen 518020,China;2 Jiamusi Municipal Center for Disease Control and Prevention,Jiamusi 154002,China;3 Department of Plastic Surgery, Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China.Corresponding author:LIU Dalie.

ObjectiveTo observe changes of immunogenicity of keratinocytes(KC)under the influence of interferon-γ (IFN-γ).MethodsKC were cultured and passaged in vitro.Different dose of IFN-γ stimulated KC to express MHC-Ⅱmolecules.KC with highty expressed MHC-Ⅱmolecules were mixed with allogenic lymphocytes to observe their proliferation.Simultaneously,MHC-Ⅱ+KC were implanted subcutaneously into allogenic mice to observe the sign of immunological rejection.ResultsUnder the influence of 6 000 U/mL IFN-γ,the percentage of MHC-Ⅱ＋KC exceeded 90%.MHC-Ⅱmolecules highly expressed KC had no effects to stimulate proliferation of allogenic lymphocytes significantly. There were no obvious lymphocytes infiltration when MHC-Ⅱmolecules highly expressed KC were implanted subcutaneously into allogenic mice.ConclusionPassaged KC could express MHC-Ⅱmolecules highty in the influence of IFN-γ,KC expressed MHC-Ⅱmolecules has no obvious immunogenicity.

IFN-γ;MHC-Ⅱ;Keratinocyte;Immunogenicity

R392.12

A

1673－0364（2010）05－0248－05

2010年7月21日，

2010年8月18日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（30570517）。

518020廣東省深圳市深圳市人民醫(yī)院（宋仁剛）；154002黑龍江省佳木斯市佳木斯市疾病控制中心（宋任強(qiáng)）；510282廣東省廣州市南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院整形科（柳大烈）。

柳大烈