牛羊肉中三聚氰胺的HPLC快速檢測

李巧玲，安 源，張艷川，楊 金

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.長春大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130012)

牛羊肉中三聚氰胺的HPLC快速檢測

李巧玲1，安 源2，張艷川1，楊 金1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.長春大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130012)

建立高效液相色譜(HPLC)檢測牛、羊肉中三聚氰胺的檢測方法。樣品經(jīng)1%三氯乙酸-乙腈(3:1，V/V)提取，利用陽離子交換固相萃取柱凈化后，洗脫液于50℃條件下用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)秒x子對試劑緩沖液-乙腈(90: 10，V/V)溶解，用高效液相色譜法由紫外檢測器檢測、外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，三聚氰胺在0.2～80μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9999，其檢出限為0.05mg/kg。在牛肉樣品中，三聚氰胺的平均回收率為81.73%～83.35%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～1.95%；在羊肉樣品中，三聚氰胺的平均回收率為80.95%～82.95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%～2.32%。本方法具有操作快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

三聚氰胺；牛肉；羊肉；高效液相色譜

從“寵物飼料事件”到“三鹿問題奶粉事件”，再到“雞蛋中檢出三聚氰胺”，三聚氰胺已經(jīng)成為食品公共安全的焦點(diǎn)[1-3]。三聚氰胺(melamine)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料。由于其含氮量高達(dá)66%，換算成粗蛋白含量為416.27%[4]，在“凱氏定氮法”中可以表現(xiàn)出“高蛋白質(zhì)含量”的假象，所以成了“三鹿奶粉”事件中的主角。

關(guān)于三聚氰胺對人的毒性報道較少，大部分是動物研究的結(jié)果。三聚氰胺的毒作用靶器官為膀胱和腎臟，實(shí)驗(yàn)顯示14C標(biāo)記的三聚氰胺進(jìn)入Fischer344大鼠體內(nèi)后主要分布于血液、肝臟、腎和膀胱等器官[5-7]。三聚氰胺既然能進(jìn)入血液，推測其也能通過代謝在肉組織中有殘留。既然有殘留，殘留量能否對攝入該肉的人體產(chǎn)生危害，就成為一個很值得關(guān)注的問題。既然雞蛋中能檢出殘留的三聚氰胺[3]，推測食飼料的動物的肉中也有可能檢出三聚氰胺。

2008年10月7日國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會批準(zhǔn)發(fā)布了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22388—2008)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法3種方法為三聚氰胺的檢測方法，檢測定量限分別為2、0.05、0.01mg/kg[8]。目前，對于鮮肉中三聚氰胺殘留的檢測研究報告還較少[9]，因此本研究在GB/T 22388—2008的基礎(chǔ)上，通過對樣品前處

理方法進(jìn)行改進(jìn)，研究牛、羊肉中三聚氰胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛、羊肉購買于超市。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于 99.0%) 河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院；甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉(均為色譜純)；檸檬酸、三氯乙酸(均為分析純)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；氮?dú)?純度大于99.999%)；0.2μm有機(jī)相微孔濾膜 天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀(配有SPD-20A檢測器和LC solution工作站) 日本Shimadzu公司；AL204分析天平 梅特勒-托利多有限公司；XYJ-3臺式自動平衡離心機(jī) 春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；SK5200LHC超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；氮?dú)獯蹈蓛x 上海濟(jì)成分析儀器有限公司；ProElut陽離子交換固相萃取柱 Dikma科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

甲醇水溶液、三氯乙酸溶液(1%)、氨化甲醇溶液(5%)、離子對試劑緩沖液以及三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制見參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用流動相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到的質(zhì)量濃度為0.2、0.8、2、20、40、80μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各取20μL上色譜儀進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 樣品的處理

選取新鮮牛肉、羊肉樣品約500g，分別切碎后，裝入潔凈盛樣袋內(nèi)，密閉并標(biāo)識，冷凍于冰箱中。

取適量上述樣品于干凈的研缽中，研磨成漿狀后稱取2g(精確至0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入12mL 1%三氯乙酸溶液和4mL乙腈，超聲提取8min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)1%三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，殘?jiān)俳?jīng)上述過程提取一次，然后合并濾液，用1%三氯乙酸溶液定容至35mL，移取7mL濾液，加入7mL水混勻后轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3mL水、3mL甲醇和6mL氨化甲醇溶液洗脫。洗脫液于50℃條件下用氮?dú)獯蹈桑?.4g殘留物，用1mL流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。

1.2.4 液相色譜條件

色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為離子對試劑緩沖液-乙腈(90:10，V/V)，檢測波長240nm，流速1.0mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL。

1.2.5 三聚氰胺含量的計算

試樣中三聚氰胺含量的計算參見參考文獻(xiàn)[8]中的計算公式。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

根據(jù)GB/T 22388—2008相關(guān)資料，選取1%三氯乙酸-乙腈溶液(3:1，V/V)為提取劑。精確稱取2g供試樣品并添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(1μg/mL)250μL于干凈的研缽中，研磨成漿狀后放入50mL塑料離心管中，加入16mL提取劑高速均質(zhì)2min，后面的操作步驟和1.2.3節(jié)相同，高效液相色譜的測定結(jié)果見表1。

表1 以三氯乙酸-乙腈為提取劑三聚氰胺的回收率Table 1 Recovery of melamine in mutton and beef extracted with a mixture of trichloroacetic acid and acetonitrile mixture (3:1，V/V)

從表1可以看出，1%三氯乙酸-乙腈溶液對于兩種樣品中三聚氰胺的提取效果比較好，所以確定本實(shí)驗(yàn)的提取劑為1%三氯乙酸-乙腈溶液。

2.2 提取液凈化條件的選擇

在三聚氰胺的檢測分析實(shí)驗(yàn)中，固相萃取法是最為常用的凈化方法。萃取柱常使用以高聚物為基質(zhì)的親水-親脂混合型陽離子交換柱，苯磺酸基屬于強(qiáng)陽離子交換功能團(tuán)，在任何pH值條件下都為帶負(fù)電荷的陰離子[10]。因此，只要控制樣品溶液的pH值使三聚氰胺呈陽離子狀態(tài)，就能夠被苯磺酸基通過離子交換方式吸附。在樣品溶液中，三聚氰胺已經(jīng)是在酸性條件，故本實(shí)驗(yàn)采用ProElut陽離子交換固相萃取柱(基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物)凈化提取液，結(jié)果表明，其凈化結(jié)果較為理想。

2.3 分析的線性范圍和檢出限

40μg/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖見圖1，三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2可看出，三聚氰胺在0.2～80μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)的色譜條件，將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)稀釋，同供試樣品進(jìn)行研磨、提取、凈化后進(jìn)樣分析，根據(jù)3倍噪音的峰面積響應(yīng)值和方法回收率，可以得到最低檢出限[11]。測定表明，三聚氰胺的檢出限為0.05mg/kg。此數(shù)值小于國標(biāo)《原料乳與乳制品中三聚

氰胺檢測方法》中高效液相色譜法的檢測定量限2mg/kg，完全可以滿足對肉中三聚氰胺殘留的分析。

圖1 40 μg/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of melamine standard solution at 40 μg/mL

圖2 三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of melamine

2.4 回收率的測定

本實(shí)驗(yàn)分別取2g牛肉、羊肉樣品各3份，在2、4、8μg/g三個添加水平，按前述提取方法及檢測條件分別測定，同時做空白樣品兩份，每份樣品監(jiān)測6次，確定添加回收率。測得的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2、3所示。結(jié)果表明，牛肉樣品在3個添加水平下，樣品中三聚氰胺的平均回收率為81.73%～83.35%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～1.95%；羊肉樣品在3個添加水平下，三聚氰胺的平均回收率為80.95%～82.95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%～2.32%，這說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 牛肉測定的回收率(n=6)Table 2 Average spike recoveries (6 replicates) for melamine in beef at 3 levels

表3 羊肉測定的回收率(n=6)Table 3 Average spike recoveries (6 replicates) for melamine in mutton at 3 levels

2.5 牛、羊肉中三聚氰胺含量的測定

圖3 牛肉樣品的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of a beef sample

圖4 羊肉樣品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of a mutton sample

由圖1可知，三聚氰胺的保留時間在13.5min左右。圖3、4同圖1對比可知，牛肉樣品中含有三聚氰胺，羊肉樣品中不含有三聚氰胺。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]的計算公式，計算得出牛肉樣品中三聚氰胺的含量為1.064mg/kg，并且在待測物出峰的區(qū)域內(nèi)，未見干擾峰出現(xiàn)。根據(jù)國家含乳15%以上食品中三聚氰胺的限量值(2.5mg/kg)的規(guī)定，牛肉樣品中雖然檢出了三聚氰胺，但含量符合國家規(guī)定限量值。

牛肉樣品中檢出了三聚氰胺，而羊肉樣品中未檢出，分析原因可能為：牛和羊所食飼料有差異，羊吃的飼料中三聚氰胺的含量很少，或者飼料中不含有三聚氰胺，經(jīng)機(jī)體代謝后，殘留在肌肉組織中的三聚氰胺

的量低于儀器的檢出限。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)證明三聚氰胺能夠通過飼料進(jìn)入動物體內(nèi)，并在肌肉組織中有殘留，但其殘留量較少，符合國家規(guī)定限量值，食用這種肉不會對健康帶來危害。同時該研究也表明，用高效液相色譜檢測牛羊肉中的三聚氰胺的含量是可行的。該方法精密度好，準(zhǔn)確度高，檢出限低，該研究為鮮肉中三聚氰胺殘留的檢測提供了切實(shí)可行的技術(shù)手段，推廣性較強(qiáng)。

[1]宮靖, 吳燕. 寵物飼料加三聚氰胺成毒糧引發(fā)中美貿(mào)易風(fēng)波[J/OL].財經(jīng), 2007, 186(11) (2007-05-28)[2008-09-12]. http://finance.qq.com/ a/20080912/002595_1.htm.

[2]慧聰食品工業(yè)網(wǎng). 三鹿奶粉事件引發(fā)全行業(yè)信任危機(jī)[EB/OL]. (2008-09-23)[2008-09-23]. http://info.food.hc360.com/zt/slnf/index.shtml.

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Rapid HPLC Determination of Melamine in Beef and Mutton

LI Qiao-ling1，AN Yuan2，ZHANG Yan-chuan1，YANG Jin1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. Biological Scientific and Technical College, Changchun University, Changchun 130012, China)

A rapid HPLC method was developed for the determination of melamine in beef and mutton. Samples were extracted with a mixture of trichloroacetic acid and acetonitrile mixture (3:1，V/V) and cleaned up on a cation exchange solid-phase extraction (SPE) column. The eluate was blown to dryness under nitrogen at 50 ℃ and then dissolved in a mixture of ion-pair buffer and acetonitrle (90:10, V/V). The analysis was carried out using HPLC with UV detector. A good linear relationship was observed for melamine within the range of 0.2－80 μ g/mL and the linear correlation coefficient (R2) was 0.9999. The limit of detection was 0.05 mg/kg. For beef, average spike recoveries (6 replicates) at 3 levels ranged from 81.73% to 83.35%, with a relative standard deviation (RSD) from 0.97% to 1.95%. For mutton, average spike recoveries (6 replicates) at 3 levels ranged from 80.95% to 82.95%, with a RSD from 0.70% to 2.32%. The method proved to be rapid, accurate and reliable.

melamine；beef；mutton；high performance liquid chromatography

TS251.7

A

1002-6630(2010)10-0196-04

2009-08-07

教育部“留學(xué)回國人員科研啟動基金”資助項(xiàng)目(教外司留[2009]1001號)

李巧玲(1973—)，女，副教授，博士后，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。E-mail：lql98119@126.com