玉米皮多糖制備、分離純化及相對(duì)分子質(zhì)量的測定

張艷榮，于 君，劉相陽，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

玉米皮多糖制備、分離純化及相對(duì)分子質(zhì)量的測定

張艷榮，于 君，劉相陽，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

采用微波提取及95%乙醇沉淀處理制備玉米皮粗多糖，經(jīng)D315型離子交換樹脂脫蛋白，乙醇分級(jí)沉淀及Sephadex G-100、Sephadex G-75層析柱純化得CSPA-1、CSPA-2和CSPB。紫外-可見光譜在220～400nm處掃描CSPA-1、CSPA-2及CSPB，無蛋白及核酸吸收峰。純化得到的多糖經(jīng)葡聚糖凝膠層析法測得相對(duì)分子質(zhì)量分別為186170、103885、146887。

玉米皮；多糖；分離純化；相對(duì)分子質(zhì)量

Abstract：Crude corn bran polysaccharides (CBP) were obtained through microwave-assisted extraction followed by 95%alcohol precipitation, purified through D315 ion exchange resin column chromatography for the removal of protein and fractionated into 2 fractions, CBPA and CBPB, through fractional precipitation with alcohol. CBPA was further fractionated through Sephadex G-100 column chromatography into 2 subfractions, CBPA-1 and CBPA-2 of which Sephadex G-75 column elution profile exhibited a single absorption peak. Sephadex G-75 column chromatographic analysis indicated that CBPB comprised a single homogeneous composition. Neither protein nor nuclear acid characteristic absorption peaks were shown in the UV-visible spectra of CBPA-1, CBPA-2 and CBPB. The relative molecular mass of CBPA-1, CBPA-2 and CBPB were determined by the dextran gel filtration method to be 186170, 103885 and 146887 , respectively.

Key words：corn spermoderm；polysaccharide；purification；relative molecular mass

玉米是我國的主要農(nóng)作物之一。我國的玉米消費(fèi)主要用于玉米食品、飼料、化工業(yè)、種業(yè)和出口。其中飼料和工業(yè)消費(fèi)占國內(nèi)玉米消費(fèi)總量的90%。2008年我國玉米產(chǎn)量為1.5億t，玉米深加工業(yè)發(fā)展迅速，玉米加工能力達(dá)到6000萬t。目前我國玉米的精深加工主要是玉米淀粉的生產(chǎn)及其利用，而玉米非淀粉組分如玉米皮、玉米蛋白等的高附加值利用水平很低[1]。玉米非淀粉組分的產(chǎn)出量逐年增多，如何實(shí)現(xiàn)玉米各組分的高附加值綜合利用，有效延長玉米產(chǎn)業(yè)鏈，改變以消耗大量玉米原糧為代價(jià)來換取玉米經(jīng)濟(jì)發(fā)展的單一模式，成為我國玉米深加工發(fā)展的重中之重。預(yù)計(jì)2010年吉林省玉米非淀粉組分的產(chǎn)出量可達(dá)到260萬t以上，這其中玉米皮的產(chǎn)出量可達(dá)到60萬t以上。玉米皮的主要成分為半纖維素、纖維素及木質(zhì)素，是生產(chǎn)高品質(zhì)膳食纖維的良好原料，研究表明玉米皮膳食纖維對(duì)血清膽固醇的升高有明顯的抑制作用，在大腸內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的有益菌群，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，加快有毒有害物質(zhì)的排除，抗便秘、預(yù)防直腸癌的發(fā)生[2]。目前，對(duì)玉米皮膳食纖維的提取方法及保健功能報(bào)道較多[3]，而對(duì)玉米皮可溶性多糖的純化方法及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究很少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)玉米皮多糖(corn spermoderm polysaccharide，CSP)的提取、分離及純化進(jìn)行研究，并測定其相對(duì)分子質(zhì)量，為玉米皮多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮 長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

乙醇、苯酚、濃硫酸(均為分析純) 北京化工廠；Folin-酚(分析純) 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠、Sephadex G-75葡聚糖凝膠、藍(lán)色葡聚糖 瑞典Pharmacia公司；Dextran T10、T40、T70、T500 美國Sigma公司；D315離子交換樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HA121-50-02型超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；NN-J993型微波爐 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；層析柱 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSZ-160F型自動(dòng)收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；UV2300紫外-可見光分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將濕法生產(chǎn)玉米淀粉時(shí)產(chǎn)生的玉米皮在流動(dòng)水下反復(fù)沖洗，除去殘存的胚芽、胚乳顆粒、淀粉及鹽類等成分，離心脫水，室溫條件下自然晾曬或低于60℃的條件下干燥至水分含量低于8%，粉碎至可全部通過0.125mm孔徑篩的玉米皮粉，采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)對(duì)其進(jìn)行脫脂脫異雜味處理[4]，條件為CO2流量22L/h、萃取壓力25MPa、萃取溫度45℃、萃取時(shí)間90min。萃取后玉米皮中脂肪含量為0.16%。

1.3.2 多糖的提取

取經(jīng)1.3.1節(jié)預(yù)處理后玉米皮100g，加入10倍體積的蒸餾水，采用微波浸提的方法提取玉米皮多糖，微波功率700W、微波處理時(shí)間6min，然后4000r/min離心處理10min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至原體積的10%。將濃縮液加入其3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，靜置6h以上，4000r/min離心10min，收集沉淀，冷凍干燥得可溶性玉米皮粗多糖。

1.3.3 脫蛋白

采用D315離子交換樹脂脫除多糖中蛋白質(zhì)及小分子雜質(zhì)。將處理好的樹脂裝填于3.5cm×60cm的層析柱中，填料高度為50cm。用去離子水將粗多糖溶解，配成質(zhì)量濃度為3mg/mL的多糖溶液，上樣后，用去離子水蠕動(dòng)泵洗脫，流速1mL/min，至苯酚-硫酸法檢測無糖流出[5]。在收集液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置6h后，4000r/min離心10min，收集沉淀，采用Folin-酚試劑法測蛋白的脫除率[6]，按下式進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)檢測蛋白脫除率為79.18%。

1.3.4 分級(jí)沉淀

將多糖配成質(zhì)量濃度2g/100mL的多糖液，分別用終體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%的乙醇溶液沉淀處理6h，4000r/min離心10min，離心后沉淀先后用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，收集沉淀，干燥備用[7-9]。

1.3.5 多糖的分離純化

配成質(zhì)量濃度0.4mg/mL的多糖液用Sephadex G-100及Sephadex G-75層析柱進(jìn)行分離純化，用去離子水洗脫，自動(dòng)收集器分部收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，直至無糖流出為止。

1.3.6 多糖的紫外光譜分析[10]

將質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的多糖溶液在190～500nm處進(jìn)行紫外光譜掃描，檢測在260nm和280nm處是否有核酸和蛋白質(zhì)吸收，檢測多糖純化程度。

1.3.7 多糖相對(duì)分子質(zhì)量測定[11-12]

對(duì)于黏度大的多糖，可采用黏度法測相對(duì)分子質(zhì)量，此方法最大的缺點(diǎn)是只能檢測高聚物的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量，而寡糖的聚合物在多數(shù)情況下是不均一的，因此采用黏度法不能精確地測定某一多糖混合物中各個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量[13]。采用葡聚糖凝膠層析法測定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量可避免黏度法的上述缺陷。利用不同方法測定多糖相對(duì)分子質(zhì)量可以從不同角度對(duì)多糖相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行確定，同時(shí)也是對(duì)多糖純度的考察。在檢測過程將Sephadex G-100層析柱(1.6cm×60cm)先用兩倍柱床體積的去離子水平衡。用已知相對(duì)分子質(zhì)量的Dextran T500、T70、T40、T10分別相繼上柱，上柱量各為5mg，去離子水洗脫流速控制在10min/管，分部收集，苯酚-硫酸法檢測多糖分布，得出不同分子量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖各自的洗脫體積Ve，然后再用藍(lán)色葡聚糖(平均相對(duì)分子質(zhì)量為2×106)上柱，求得柱的外水體積V0，以Ve/V0為縱坐標(biāo)，lgMr為橫坐標(biāo)，做出lgMr-Ve/V0標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣條件下測定多糖樣品的洗脫體積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出每一組分多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分級(jí)

采用乙醇分級(jí)沉淀多糖，當(dāng)乙醇終體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，無多糖沉淀；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)可得多糖沉淀占總量的78.47%，此部分命名為CSPA(cornspermoderm polysaccharide A，CSPA)；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)得到多糖沉淀占總量的18.12%，此部分命名為 CSPB(corn spermoderm polysaccharide B，CSPB)；乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)可得多糖沉淀占總量的3.4%，此部分含量較低，收集困難，因此舍去。

2.2 多糖的分離純化

Sephadex G-100凝膠柱分離純化CSPA，上樣量8mL，去離子水洗脫流速控制在40min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖1。由圖1可以看出，經(jīng)過Sephadex G-100凝膠柱分離純化，可以較好的將CBPA分為兩個(gè)組分，第一個(gè)組分是從一開始到26管的部分，命名為CSPA-1，峰形基本上呈正態(tài)分布，證明該組分具有較好的均一性[14]。第二個(gè)組分是從第31到第61管的部分，命名為CBPA-2，峰形雖然接近正態(tài)分布，但存在起伏，因此收集CSPA-2濃縮至10mL后Sephadex G-75凝膠柱層析，去離子水洗脫流速控制在15min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖2。從圖2可以看出，CSPA-2的Sephadex G-75洗脫曲線接近正態(tài)分布，為單一峰，證明CBPA-2為較均一的組分。將CSPB上Sephadex G-100凝膠柱分離純化，上樣量10mL，去離子水洗脫流速控制在30min/管，經(jīng)苯酚-硫酸顯色，可得到洗脫曲線見圖3。由圖3可以看出，CSPB的Sephadex G-100洗脫曲線在第21管處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的主峰，接近正態(tài)分布，但在35管處出現(xiàn)了一個(gè)小峰，造成這種現(xiàn)象的原因可能是CSPB中含有兩種相對(duì)分子質(zhì)量相差不大的組分，它們?cè)谀z柱上分離效果不好。為了能夠得到相對(duì)分子質(zhì)量較為均一的多糖，只對(duì)11～35管的洗脫液進(jìn)行集中收集進(jìn)一步研究。

圖1 CSPA的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.1 Sephadex G-100 elution profile of CBPA

圖2 CSPA-2的Sephadex G-75洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-75 elution profile of CBPA-2

圖3 CSPB的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.3 Sephadex G-100 elution profile of CBPB

2.3 多糖的紫外-可見光譜分析

圖4 CSPA-1的紫外-可見光譜掃描Fig.4 UV-visible spectrogram of CBPA-1

由圖4可知，對(duì)CSPA-1、CSPA-2、CSPB進(jìn)行紫外掃描，3個(gè)多糖組分在260nm及280nm處均無核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，表明多糖組分中蛋白質(zhì)脫除效果較好，已得到純化的多糖組分。

2.4 多糖相對(duì)分子質(zhì)量測定

用藍(lán)色葡聚糖測定Sephadex G-100層析柱的外水體積V0為18.4mL，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T500、T70、T40及T10的洗脫體積Ve分別為20.6、40.2、45.2、62.4mL，按lgMr-Ve/V0關(guān)系作圖得相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。根據(jù)CSPA-1、CSPA-2、CSPB各自的洗脫體積分別為29.8、36.2、32.4mL，代入回歸方程y＝－0.7284x＋6.4496可得CSPA-1、CSPA-2、CSPB的相對(duì)分子質(zhì)量分別為186170、103885、146887。

圖5 多糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve for dextran with different molecular masses

3 結(jié) 論

隨著天然產(chǎn)物的功效成分成為國內(nèi)外研究重點(diǎn)，具有生物活性的植物多糖備受關(guān)注。多糖的生物活性與多糖的溶解度、黏度、相對(duì)分子質(zhì)量等密切相關(guān)，溶解度越大，黏度越小，活性越高；具有剛性結(jié)構(gòu)的大分子多糖，幾乎不溶于水，生物活性較低，只有相對(duì)分子質(zhì)量適中的多糖，才具有較強(qiáng)的生理活性[15]。不同提取方法及不同的純化過程所得到的多糖組成和相對(duì)分子質(zhì)量可能不一致，這是多糖構(gòu)效研究的一個(gè)難點(diǎn)。本研究采用乙醇分級(jí)沉淀的方法對(duì)玉米皮粗多糖進(jìn)行初步分級(jí)，通過Sephadex G-100、Sephadex G-75層析柱進(jìn)一步分離純化，得到3種多糖CSPA-1、CSPA-2、CSPB，紫外光譜掃描均無蛋白及核酸吸收峰。采用葡聚糖凝膠層析法測定3種多糖的相對(duì)分子質(zhì)量約為186170、103885、146887。證明采用95%乙醇溶液一步沉淀法獲得的玉米皮多糖是一種混合多糖，且相對(duì)分子質(zhì)量較大(均大于100000)，可推斷其生理活性及保健功能較弱[16]，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行降解及功能化處理，方可適于健康食品的生產(chǎn)。另外應(yīng)對(duì)其單糖及糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究，以利于對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的探索。

[1] 張艷榮, 王大為, 祝威. 高品質(zhì)玉米膳食纖維生產(chǎn)工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(9): 213-217.

[2] 王遂, 崔凌飛, 尤旭. 玉米皮半纖維素提取工藝的研究[J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2000(3): 49-53.

[3] 張艷榮, 劉婷婷, 王大為. 玉米活性多糖減肥降脂作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(5): 227-230.

[4] 侯卓, 張娜, 王大為. 蒙古口蘑多糖微波提取技術(shù)的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3): 252-255.

[5] 王文平, 郭祁遠(yuǎn). 苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 276-278.

[6] 李建武. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1994:168-l70.

[7] 劉樹興, 唐孟忠. “米邦塔”食用仙人掌多糖分級(jí)新方法的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 27(4): 108-109.

[8] 郭振楚. 糖類化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 59-61.

[9] 楊海軍, 何智健, 李祥. 明黨參多糖的結(jié)構(gòu)研究[J]. 美中醫(yī)學(xué), 2007,4(6): 27-31.

[10] 董群, 方積年. 多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2001,36(10): 649-651.

[11] 陳宏亮, 李德發(fā), 常碧, 等. 蘆薈多糖德提取及結(jié)構(gòu)分析[J]. 獸藥與飼料添加劑, 2002, 7(2): 1-3.

[12] ANDREWS P. The gel-filtration behaviour of proteins related to their molecular weights over a wide range[J]. Biochem J, 1965, 96(3): 595-606.

[13] 方積年. 多糖的分離純化及其純度鑒別與分子量測定[J]. 藥學(xué)通報(bào),1984, 19(10): 46-49.

[14] 傅明輝, 林總?cè)A. 沙棘果水溶性多糖的分離純化、組分分析及抗氧化學(xué)性的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(3): 73-75.

[15] 肖朱洋. 多糖的結(jié)構(gòu)分析與構(gòu)效關(guān)系[J]. 海峽藥學(xué), 2007, 19(3): 98-100.

[16] 諸葛健, 趙振鋒, 方慧英. 功能性多糖的構(gòu)效關(guān)系[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 21(2): 208-210.

Isolation, Purification and Relative Molecular Mass Determination of Corn Bran Polysaccharides

ZHANG Yan-rong，YU Jun，LIU Xiang-yang，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

S513

A

1002-6630(2010)10-0016-04

2010-03-02

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z336)

張艷榮(1965—)，女，教授，博士，主要從事糧油精深加工與開發(fā)研究。E-mail：xcpyfzx@163.com

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，主要從事功能性食品開發(fā)研究。E-mail：xcpyfzx@163.com