響應面法優化陰離子淀粉微球吸附性能研究

薛 博，李新華,*，朱旻鵬

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽師范大學化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 110034)

響應面法優化陰離子淀粉微球吸附性能研究

薛 博1，李新華1,*，朱旻鵬2

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽師范大學化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 110034)

以精氨酸為模型藥物，采用響應面法優化陰離子淀粉微球的吸附性能。在單因素試驗的基礎上選取離子化劑用量、反應溫度、浸泡時間和反應時間為影響因子，應用中心組合(CCD)進行四因素五水平的試驗設計，以陰離子淀粉微球吸附量作為響應值，進行響應面分析(RSA)。結果表明，陰離子淀粉微球吸附精氨酸含量的最佳優化條件為三聚磷酸鈉用量0.82g、反應溫度80.52℃、浸泡時間12h、反應時間1h。精氨酸吸附量預測值為3.341mg/g，驗證值為3.308mg/g，與預測值相差0.033mg/g，比陰離子化前吸附量提高了95.16%。

陰離子淀粉微球；吸附載藥；精氨酸

淀粉微球因具有生物相容性、生物降解性、無毒性、貯存穩定、原料來源廣泛、價格低廉等優點，已作為靶向制劑的藥物載體在醫藥衛生領域得到廣泛研究和應用[1]。目前，淀粉微球的載藥主要通過其在藥液中溶脹吸附的方式載藥，由于微球與藥物間僅存在單純的物理吸附，載藥量很有限，藥物緩釋性差，影響其使用效果。提高淀粉微球對藥物的吸附性能已經成為研究熱點。采用減小微球粒徑，增加微球的比表面積的手段可提高微球對藥物的吸附，但代價很高[2-4]，而對微球進行離子化，使其能夠吸附帶相反電荷的離子型藥物，是一種改善微球吸附性能的有效方法，目前對淀粉微球進行離子化的研究報道較少，且多以亞甲基藍等帶電荷染料為模型藥物研究微球的吸附性，缺乏離子化微球對藥物的吸附研究[5-9]。實驗以可溶性淀粉為原料，環氧氯丙烷為交聯劑，采用反相懸浮法合成中性淀粉微球。通過實驗選擇吸附性能最好的中性淀粉微球，以三聚磷酸鈉為離子化劑對微球進行陰離子化，以帶正電荷的精氨酸為模型藥物，采用響應面法優化微球的吸附性能，為陰離子淀粉微球做為藥物載體提供理論和實踐上的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可溶性淀粉、乳化劑Span60、液體石蠟、氫氧

化鈉、環氧氯丙烷、乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮、三聚磷酸鈉、精氨酸，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1600紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；JB90-S數字顯示轉速電動攪拌機 上海標本模型廠制造；NICLET380傅里葉紅外光譜儀 Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉微球的制備

準確量取60mL液體石蠟倒入燒杯中，加入一定量的Span60，于60℃水浴加熱使Span60溶解，然后倒入三口燒瓶中，于50℃恒溫水浴保溫攪拌作為油相。取可溶性淀粉(提前烘干水分)，配成質量分數10%淀粉溶液，用2mol/L NaOH溶液調節pH12，淀粉溶液于電爐上加熱糊化至透明，冷卻至50℃，用刻度吸管吸取20mL淀粉溶液。逐滴加入環氧氯丙烷，磁力攪拌600r/min、50℃保溫，回流，反應5h。反應結束后，3000r/min離心10min，依次用乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮洗滌，40℃真空干燥得到淀粉微球。

1.3.2 陰離子淀粉微球的制備

精確稱取1g中性淀粉微球，加入20mL蒸餾水，加入一定量三聚磷酸鈉(Na5P3O10)，攪拌分散均勻，調節pH11.5，浸泡一段時間，然后4000r/min離心5min，用體積分數95%乙醇洗滌3次，離心，淀粉在45℃烘箱中干燥30min，然后迅速升溫，高溫反應一定時間，即得陰離子淀粉微球。

1.3.3 陰離子淀粉微球吸附性能測定

以蒸餾水為介質，配制20μg/mL的精氨酸溶液。取0.5g干燥的陰離子淀粉微球于100mL容量瓶中，加入精氨酸溶液100mL，30℃恒溫避光吸附1h。取吸附液10mL，0.45μm濾膜過濾，采用茚三酮比色法測濾液精氨酸的吸附量。

1.3.4 單因素試驗

固定其他因素不變，考察三聚磷酸鈉用量、反應時間、浸泡時間和反應溫度4個影響因素對陰離子淀粉微球吸附性能的影響規律，以吸附量為指標進行試驗測定。

1.3.5 陰離子化淀粉微球的紅外光譜分析

分別取可溶性淀粉、淀粉微球(中性微球)和陰離子淀粉微球各約1mg，置瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr細粉150～200mg，充分研磨混勻，在烘箱中干燥7～ 8min，移置于壓模中壓片。將樣品進行IR分析，記錄500～4000cm-1范圍的紅外光譜圖。

1.3.6 響應面法對陰離子淀粉微球吸附性能的優化

綜合單因素試驗結果，應用中心組合(central composite design，CCD)設計原理，選取三聚磷酸鈉用量、反應時間、浸泡時間和反應溫度4個影響因素，在單因素試驗的基礎上采用四因素五水平的響應面分析方法，對陰離子微球的制備工藝進行優化，進一步提高其吸附能力，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Variables and levels in the 4-variable, 5-level CCD

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 三聚磷酸鈉用量對陰離子淀粉微球吸附性能的影響

圖1 不同三聚磷酸鈉用量對陰離子淀粉微球吸附性能的影響Fig.1 Effect of sodium tripolyphosphate on the adsorption capacity

由圖1可知，隨著三聚磷酸鈉用量的增加，陰離子淀粉微球的吸附量呈現先增大后減小的趨勢，當三聚磷酸鈉用量為0.6g時，微球對精氨酸吸附量達到最大值3.65mg/g。三聚磷酸鈉用量的增加會使微球帶有更多的負電荷，增加了微球與精氨酸間的靜電引力，使吸附量增加。

2.1.2 反應時間對陰離子淀粉微球吸附性能的影響

由圖2可知，反應時間在1～3h范圍內變化對精氨酸吸附量的影響呈現一定的波動性，吸附量最大值出現在1.5h，繼續延長反應時間陰離子淀粉微球吸附量變化不大，而且隨著反應時間的延長，產品顏色逐漸變黃，這是因為當反應時間過長時，淀粉分子發生降解或焦化。

圖2 不同反應時間對陰離子淀粉微球吸附性能的影響Fig.2 Effect of reaction time on the adsorption capacity

2.1.3 浸泡時間對陰離子淀粉微球吸附性能的影響

圖3 不同浸泡時間對陰離子淀粉微球吸附性能的影響Fig.3 Effect of soaking time on the adsorption capacity

由圖3可知，隨著浸泡時間的增加，陰離子淀粉微球的吸附量呈上升趨勢，但浸泡時間超過10h后吸附量不再增加。

2.1.4 反應溫度對陰離子淀粉微球吸附性能的影響

圖4 不同反應溫度對陰離子淀粉微球吸附性能的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the adsorption capacity

由圖4可知，隨著反應溫度的升高，陰離子淀粉微球對精氨酸的吸附量先升高后降低。當反應溫度達到100℃時，陰離子淀粉微球吸附量達到最大，這是因為在一定溫度范圍內，溫度升高，能量增加，使分子的活性增加，有利于淀粉鏈間氫鍵斷裂，從而可以讓更多的磷酸鹽分子接近羥基進行反應，使微球帶有更多負電荷，但當反應溫度過高時，淀粉分子熱降解，甚至可能焦化，因而反應溫度超過100℃后微球吸附量不斷減小。

2.2 紅外光譜分析

圖5 可溶性淀粉、中性淀粉微球和陰離子淀粉微球紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of soluble starch microspheres, neutral starch microspheres and anionic starch microspheres

可溶性淀粉、淀粉微球(中性微球)和陰離子化淀粉微球的紅外光譜圖見圖5。由圖5可知，3條紅外光譜曲線在3440cm-1附近出現了—OH伸縮振動吸收峰，表明官能團—OH在交聯前后都存在，隨著交聯程度的增加，紅外光譜的羥基峰逐漸變窄；陰離子化反應后的紅外光譜曲線在1200cm-1附近出現新的吸收峰。從脂肪磷化合物基團的振動規律來看，磷酰基P=O的伸縮振動吸收帶，在不同結構的化合物中位置分布很寬，可在1400～1175cm-1之間出現，因此可以認定，陰離子化微球在1215cm-1附近出現的峰為P=O的伸縮振動吸收峰[10]。并且淀粉紅外光譜中其他官能團的特征吸收峰并沒有明顯的變化。由此可以推斷，淀粉的羥基確實已經被取代。說明離子化處理后的淀粉并未破壞原淀粉的基本結構，陰離子化反應只是在原來的淀粉分子鏈上增加了新的基團。

2.3 中心試驗設計與響應面分析

2.3.1 響應曲面試驗設計

對三聚磷酸鈉用量、反應時間、浸泡時間和反應溫度4個影響因素使用Design-Expert 7.1軟件設計四因素五水平共30個試驗(6個中心點)的響應面分析試驗。這30個試驗點可分為兩類：一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共24個析因點；二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復6次，用以估計試驗誤差，陰離子淀粉微球對精氨酸的吸附量為響應值(指標值)，響應面試驗數據見表2。

表2 響應中心組合試驗設計及結果Table 2 CCD matrix and corresponding experimental results of the adsorption capacity

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted regression equation

應用Design-Expert 7.1對響應面試驗數據進行分析和顯著性檢驗，結果見表3。

采用Design-Expert 7.1軟件對響應面試驗數據進行分析后，使用“Quadratic”(二次方程式)的數學模型。陰離子淀粉微球對精氨酸吸附量的數學模型如下：

對模型進行方差分析結果(表3)可知，用上面所得的方程描述因子回歸得P＜0.001，方程回歸極顯著，一次項、二次項也極其顯著，說明用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，即這種試驗方法是可靠的。從回歸方程各項方差的進一步檢驗也可知，X1和X3是影響陰性淀粉微球吸附量的關鍵因子。X1對試驗結果影響最顯著(P＜0.001)，其次是X3(P＜0.001)；X2和X4對試驗結果影響不太顯著。另外，方程的失擬項P＝0.0991＞0.05，不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。回歸模型預測的最佳陰離子淀粉微球吸附量工藝條件為三聚磷酸鈉用量0.82g、反應溫度80.52℃、浸泡時間12h、反應時間1h。

2.3.3 陰離子淀粉吸附量的響應面曲面分析與優化

圖6 Y = f(X1, X2)的響應面圖Fig.6 Response surface stereogram of Y = f(X1, X2)

圖7 Y = f(X1, X3)的響應面圖Fig.7 Response surface stereogram of Y = f(X1, X3)

圖8 Y = f(X1, X4)的響應面圖Fig.8 Response surface stereogram of Y = f(X1, X4)

圖9 Y = f(X2, X3)的響應面圖Fig.9 Response surface stereogram of Y = f(X2, X3)

圖10 Y = f(X2,X4)的響應面圖Fig.10 Response surface stereogram of Y = f(X2,X4)

圖11 Y = f(X3, X4)的響應面圖Fig.11 Response surface stereogram of Y = f(X3, X4)

陰離子淀粉吸附量優化的響應曲面及其等高線如圖6～11所示。6組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。比較6組圖可知，反應時間(X2)與浸泡時間(X3)、浸泡時間(X3)和反應溫度(X4)交互作用顯著，對陰離子淀粉吸附量影響較為顯著，表現為曲線較陡。

為檢驗RSA法的可靠性，采用上述最優離子化條件制備陰離子化淀粉微球，測定其對精氨酸吸附量為3.308mg/g，與理論值差0.033mg/g左右，較中性淀粉微球吸附量1.695mg/g，提高了95.16%。

3 結 論

基于試驗設計軟件Design-Expert 7.1，通過二次回歸設計得到了陰離子淀粉微球對精氨酸吸附量與陰離子化劑用量、反應時間、浸泡時間、反應溫度關系的回歸模型，經檢驗證明該模型合理可靠，得到的優化工藝參數為三聚磷酸鈉用量0.82g、反應溫度80.52℃、浸泡時間12h、反應時間1h，在此條件下，精氨酸吸附量驗證值為3.308mg/g，較中性淀粉微球吸附量提高了95.16%。因此，采用RSA法優化陰離子淀粉微球得到的條件參數準確可靠，微球吸附性能提高顯著。

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Optimization of Adsorption Capacity of Anionic Starch Microspheres Using Response Surface Methodology

XUE Bo1，LI Xin-hua1,*，ZHU Min-peng2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Chemistry and Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Response surface methodology (RSM) was used to optimize the adsorption capacity of anionic starch microspheres to arginine used as a drug model. A series of single-factor experiments was carried out to investigate the respective effects of 4 independent variables, including sodium tripolyphosphate amount, reaction temperature, length of soaking time and length of reaction time. Subsequently, a mathematical mode for the adsorption capacity as a function of the above variables was established based on a 4-variable, 5-level central composite design (CCD). Finally, the interactive effects of the independent variables on the adsorption capacity were examined using response surface analysis. The results showed that the optimal values of sodium tripolyphosphate amount, reaction temperature, length of soaking time and length of reaction time were determined to be 0.82 g, 80.52 ℃, 12 h and 1 h, respectively. Under the optimized parameters, the adsorption capacity was predicted to be 3.341 mg/g and observed to be 3.308 mg/g, 0.033 mg/g higher than the predicted value, with an increase by 95.16% than before the optimization.

anionic starch microspheres；adsorption medicament；arginine

TQ028.15

A

1002-6630(2010)10-0163-05

2009-08-07

薛博(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品深加工與轉化。E-mail：xuebo0601@hotmail.com

*通信作者：李新華(1955—)，男，教授，博士，研究方向為農產品深加工與轉化。E-mail：Lixh.syau@163.com