重組人生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Survivin和Caspase-3表達(dá)的影響

郭耀強(qiáng) 白宏英 曾志磊 劉海濤 方李鴻

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human grow th hormone, rhGH)在1986年通過(guò)基因工程技術(shù)合成,與人生長(zhǎng)激素(human grow th hormone,hGH)結(jié)構(gòu)相同,目前主要用于治療生長(zhǎng)激素缺乏性侏儒癥、燒傷、抗炎及不育癥等。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究表明,生長(zhǎng)激素具有減輕大腦缺血缺氧引起的損傷,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活等作用[1-4],但機(jī)制還不十分清楚。目前,尚未有生長(zhǎng)激素對(duì)腦缺血/再灌注損傷后Survivin、Caspase-3表達(dá)影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用rh-GH觀察大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Survivin、Caspase-3表達(dá)的變化,探討其神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制,為臨床治療探索新的方法及思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體質(zhì)量250～280 g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前禁食12 h,禁水4 h。隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組(腦缺血/再灌注+生理鹽水組)、治療組(腦缺血/再灌注+rhGH組)3組,每組24只。

1.2 主要試劑和藥物 重組人生長(zhǎng)激素注射液由長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn);Survivin多克隆抗體及Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ生物技術(shù)公司。

1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備及處理 線栓法大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型采用改良的 Longa[5]線栓法,大腦中動(dòng)脈(MCA)阻斷2 h后,將尼龍栓線拔出,實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插線外,其余步驟與對(duì)照組和治療組相同。參照Z(yǔ)ea Longa 5級(jí)4分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5],評(píng)分為1～3分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入選。治療組在腦缺血/再灌注模型成功后開(kāi)始頸部皮下注射重組人生長(zhǎng)激素0.1 U?kg-1?d-1,1次/24 h。對(duì)照組注射同樣劑量生理鹽水,注射時(shí)間與次數(shù)同治療組。

1.4 組織切片和免疫組化檢測(cè) 分別于腦缺血/再灌注后1、3、5、7 d處死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋和切片。常規(guī)脫蠟、水化,取缺血側(cè)大腦皮質(zhì),按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,DAB顯色,光鏡下觀察,胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性著色。

1.5 免疫組化結(jié)果分析 在光鏡下觀察 Survivin和Caspase-3免疫反應(yīng)的結(jié)果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科學(xué)儀器有限公司)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像定量分析。Survivin和Caspase-3免疫組化染色標(biāo)記強(qiáng)度用灰度值表示,比較各組陽(yáng)性區(qū)平均灰度值的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理,各組數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大腦皮質(zhì)Survivin表達(dá)的變化 假手術(shù)組大鼠腦組織中Survivin僅有少量表達(dá),對(duì)照組1～3 d達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達(dá),較假手術(shù)組顯著升高;治療組較對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大腦皮質(zhì)Caspase-3表達(dá)的變化 Caspase-3在假手術(shù)組少量表達(dá),對(duì)照組1～3 d達(dá)到高峰,后開(kāi)始下降,至7 d時(shí)仍高于假手術(shù)組;治療組較對(duì)照組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組Survivin表達(dá)的變化(陽(yáng)性區(qū)平均灰度表示)

表2 各組Caspase-3表達(dá)的變化(陽(yáng)性區(qū)平均灰度表示)

3 討論

腦缺血/再灌注損傷是一種常見(jiàn)的、復(fù)雜的病理生理過(guò)程。有研究表明[6],腦缺血后隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),缺血側(cè)皮層凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加,主要分布在梗死灶邊緣區(qū), 48 h凋亡細(xì)胞達(dá)到高峰,說(shuō)明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease,Caspase)特別是Caspase-3處于凋亡過(guò)程的下游階段,是凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶,及時(shí)抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶,挽救缺血半暗帶區(qū)尚未凋亡的神經(jīng)元是腦血管疾病治療的關(guān)鍵。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員,是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制細(xì)胞凋亡,又能誘導(dǎo)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂及生長(zhǎng)周期時(shí)相,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和血管生成等[7-8]。

腦缺血/再灌注損傷能促使缺血側(cè)腦組織Survivin強(qiáng)烈持續(xù)高表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)觀察到腦缺血/再灌注損傷后Survivin表達(dá)升高,1～3 d達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達(dá),提示Survivin在腦缺血/再灌注損傷早期即參與抗凋亡的復(fù)雜生理過(guò)程。應(yīng)用rhGH干預(yù)后Survivin表達(dá)顯著升高,說(shuō)明腦缺血/再灌注損傷早期應(yīng)用rhGH,可以增加Survivin的合成和分泌。同時(shí)發(fā)現(xiàn),腦缺血/再灌注損傷后Caspase-3表達(dá)升高,至再灌注1～3 d達(dá)到高峰,隨后開(kāi)始下降,至7 d時(shí)仍高于假手術(shù)組,結(jié)果與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致,表明腦缺血/再灌注損傷與細(xì)胞凋亡存在密切的聯(lián)系,參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程。有研究認(rèn)為[9-10],生長(zhǎng)激素可能通過(guò)NF-kappa B介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生抗凋亡蛋白Bcl-2和BAG-1,促進(jìn)細(xì)胞存活。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[2],心肌缺血/再灌注24 h后生長(zhǎng)激素組心肌細(xì)胞的凋亡以及凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均明顯少于心肌缺血/再灌注組。我們研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用rh-GH干預(yù)后Caspase-3表達(dá)較對(duì)照組顯著下降,提示 rhGH可能直接或間接通過(guò)抑制Caspase-3活性,抑制神經(jīng)元的凋亡。另有研究表明[11],Survivin可能直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性,阻斷凋亡信號(hào)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述,我們認(rèn)為腦缺血/再灌注損傷早期應(yīng)用rhGH治療,可上調(diào)Survivin表達(dá),下調(diào)Caspase-3表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,但其具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道目前尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

[1] Azcoitia I,Perez-Martin M,Salazar V,et al.Grow th hormone prevents neu ronal loss in the aged rat hippocam pus[J].Neu robiology of Aging,2005,26(5):697-703.

[2] 黃瑞健,李萌,孫培吾.生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Caspase-3 Cleaned caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2008,28(6):527-530.

[3] Shin DH,Lee E,K im JW,et al.Protective effect of grow th hormone on neuronal apoptosis after hypoxia-ischem ia in the neonatal rat b rain[J].Neuroscience Letters,2004,354(1):64-68.

[4] Scheepens A,Sirimanne ES,Breier BH,et al.Grow th horm one as a neuronal rescue factor du ring recovery from CNS inju ry[J].Neuroscience,2001,104(3):677-687.

[5] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible m iddle cerebral artery occlusion w ithout craniotomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

[6] 段智慧,白宏英,婁季宇,等.垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血皮層p-JNK表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2007,10(2):51-53.

[7] Ambrosini G,AdidaC,A ltieriDC.A novelanti-apoptosisgene, Survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nature M ed, 1997,3(8):917-921.

[8] Con te MS,A ltieri DC.Survivin regulation of vascu lar inju ry [J].T rends in Cardiovascu lar Med,2006,16(4):114-117.

[9] Jeay S,Sonenshein GE,Postel-V inay MC,etal.Grow th hormone prevents apoptosis through activation of nu clear factorkappa B in in terleukin-3-dependen t Ba/F3 cell line[J].M olecular Endocrinology,2000,14(5):650-661.

[10] Jeay S,Sonenshein GE,Kelly PA,et al.G row th hormone exertsantiapoptotic and proliferative effects through tw o different pathways involving nuc lear factor-kappa B and phosphatidylinositol 3-kinase[J].Endocrinology,2001,142(1): 147-156.

[11] Tamm T,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-Family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95),Bax,Caspases,and an tican cer drugs[J].Cancer Res,1998,58(21):5 315-5 320.