鹽酸美金剛對血管性癡呆大鼠海馬CA 1區(qū)BDNF及ERK表達(dá)的影響

張曉鋒 陳淅泠 王欣東

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部病房 鄭州 450014

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是各種腦血管病引起的獲得性智能損害和認(rèn)知障礙的綜合征,為一種慢性進行性疾病。作為一種神經(jīng)保護劑,鹽酸美金剛已被批準(zhǔn)在臨床中治療阿爾茨海默病。Kavirajan等[1]進行的一項系統(tǒng)評價和匯總分析也證實了其對血管性癡呆的療效以及較好的安全性和耐受性。目前的研究集中在鹽酸美金剛為中等親和力、非競爭性、電壓依賴性NMDA受體阻斷劑。最近的研究顯示鹽酸美金剛的神經(jīng)保護作用可能涉及其他的作用機制[2-3]。本研究通過建立血管性癡呆的大鼠模型,觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化及海馬神經(jīng)元BDNF和ERK表達(dá),探討鹽酸美金剛治療血管性癡呆的機制和神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康雄性W istar大鼠48只(河南省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供),14～15月齡,體質(zhì)量(400±50)g。

1.1.2 主要儀器及試劑:MG-2 Y-型迷宮(張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠),BDNF和ERK免疫組化試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),鹽酸美金剛(商品名易倍申,丹麥靈北藥廠制造)。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備:將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和鹽酸美金剛治療組,每組16只。給予大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,采用雙側(cè)頸總動脈(CCA)永久結(jié)扎法制備模型。將大鼠用10%的水合氯醛(0.3 m l/100g)腹腔注射,麻醉成功后仰臥固定在手術(shù)臺上,常規(guī)消毒,頸正中切口,模型組和鹽酸美金剛組分離雙側(cè)頸總動脈,4號絲線雙重結(jié)扎后,縫合切口,放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈不結(jié)扎,余操作過程相同。藥物治療組于造模術(shù)后第2天按體質(zhì)量3 mg/(kg?d)經(jīng)胃管給予鹽酸美金剛,1次/d,共6周。假手術(shù)組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 Y-型迷宮試驗:灌胃結(jié)束后用Y-型迷宮測試學(xué)習(xí)記憶能力。將大鼠放入迷宮內(nèi)適應(yīng)5 m in,使其對三臂均探索進入。然后從起步區(qū)臂出發(fā),開始以隨機次序變換測試。設(shè)定電壓75 V,延遲5 s。電擊后大鼠直接逃避至安全區(qū)為正確反應(yīng),否則為錯誤反應(yīng)。每測1次休息30 s,測10次休息5 min。以連續(xù)10次測試中有9次正確反應(yīng)即為達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn),記錄動物達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所需電擊的次數(shù),以此作為學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。24 h后,重復(fù)以上實驗過程,觀察大鼠的記憶能力。每次測試均在安靜的、光線稍暗的條件下進行。

1.2.3 H E染色和免疫組化技術(shù):Y-型迷宮試驗后,將大鼠麻醉后,立即開胸暴露心臟,迅速左心室插管,同時剪開右心房,快速灌注生理鹽水,待肝臟變白后,改灌4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)250 m l,速度先快后慢,至大鼠四肢僵硬為止,取出腦組織,置于4%多聚甲醛中浸置24 h,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋,連續(xù)冠狀切片,片厚約5μm,進行HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化,采用SP免疫組化法檢測BDNF和ERK,步驟嚴(yán)格按說明進行。

1.2.4 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)方法:采用Qwin550 CW圖像處理與分析系統(tǒng),檢測陽性反應(yīng)物質(zhì)的平均灰度值。每張切片同一區(qū)域中,隨機選取8個視野,檢測面積大致相同,采集8組數(shù)據(jù),取其平均值作為該切片目標(biāo)區(qū)域的平均灰度值。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SSPS 13.0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析法,用S-N-K法進行組間的兩兩比較。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y-型迷宮試驗 鹽酸美金剛組的學(xué)習(xí)和記憶成績高于模型組,但不及假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績 (±s)

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績 (±s)

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2.2 大鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)比較 假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多,排列緊密、均勻、整齊,胞核呈圓形或橢圓形,核仁明顯,染色質(zhì)均勻;VD組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散,數(shù)目減少,排列紊亂,胞核深染、固縮,核仁消失,胞漿周圍發(fā)現(xiàn)空暈,胞間距較大;鹽酸美金剛組正常神經(jīng)元數(shù)量較多,排列較密,胞核呈圓形或橢圓形,核仁清晰,染色質(zhì)豐富,少見固縮變性的神經(jīng)元。

2.3 大鼠海馬CA 1區(qū)免疫組化結(jié)果 BDNF和ERK免疫陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。假手術(shù)組見少量弱染及中等強度染色的BDNF陽性神經(jīng)元;模型組層次減少,排列疏松,但殘余的BDNF陽性神經(jīng)元胞漿內(nèi)著色明顯加重,呈棕黃色,并可見胞核著色;鹽酸美金剛組BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)大量增加。假手術(shù)組海馬CA 1區(qū)有大量的ERK免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元,呈棕黃色,胞體較大,圓形或橢圓形;而模型組陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,胞體變小,核固縮;鹽酸美金剛,可見陽性神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多,胞體變大。3組間的陽性區(qū)平均灰度值均有顯著性差異。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和ERK陽性區(qū)平均灰度值 (±s)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和ERK陽性區(qū)平均灰度值 (±s)

注:與假手術(shù)組相比,*P＜0.01;與模型組相比,#P＜0.01

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3 討論

本實驗病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),鹽酸美金剛能減少海馬神經(jīng)元的缺血壞死,減輕腦組織的不可逆損害,起到神經(jīng)保護作用,血管性癡呆大鼠經(jīng)鹽酸美金剛治療后Y-型迷宮試驗成績得到提高,改善了其學(xué)習(xí)與記憶能力。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor)對多巴胺能神經(jīng)元及其他神經(jīng)系統(tǒng)有營養(yǎng)及保護作用[2], M iyake等[4]學(xué)者發(fā)現(xiàn)微球體梗死動物后,BDNF的蛋白水平在海馬升高;同樣,Zhao等[5]研究表明大鼠中動脈阻塞后,大鼠缺血側(cè)前腦皮質(zhì)和海馬的BDNF水平也較對側(cè)大腦半球高,暗示缺血后損害的恢復(fù)。本實驗結(jié)果也顯示,大鼠在慢性腦缺血后海馬部位的內(nèi)源性BDNF表達(dá)增高,但這種表達(dá)水平有限,難以對受損神經(jīng)元起全面持久的保護作用,在應(yīng)用鹽酸美金剛后內(nèi)源性BDNF顯著上調(diào),而且病理組織學(xué)改變相應(yīng)減輕。ERK(含ERK 1和ERK2),又稱p44MAPK和p42M APK,是細(xì)胞內(nèi)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,p-ERK是其活性形式。ERK的底物包括細(xì)胞內(nèi)其他重要的激酶、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白以及K+通道等,這些物質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的重要組成成分,在學(xué)習(xí)記憶形成過程中必不可少,同時ERK可能參與了神經(jīng)元形態(tài)學(xué)可塑性的形成過程[6]。本研究發(fā)現(xiàn)ERK在模型組大鼠海馬CA 1區(qū)表達(dá)下降,因而推測VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與海馬CA 1區(qū)ERK表達(dá)下降有關(guān)。應(yīng)用鹽酸美金剛治療后,ERK表達(dá)增高,鹽酸美金剛可能通過促進ERK表達(dá)改善學(xué)習(xí)記憶能力。但鹽酸美金剛通過何種途徑上調(diào)BDNF和ERK的表達(dá),尚需進一步的研究。

綜上所述,鹽酸美金剛不僅可以通過拮抗NM DA受體過度活化造成的興奮神經(jīng)毒性作用,起到神經(jīng)保護作用[7],治療血管性癡呆,也可能通過提高內(nèi)源性BDNF表達(dá),起到神經(jīng)保護作用,增加ERK表達(dá),改善學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果為研究鹽酸美金剛治療血管性癡呆的機制和神經(jīng)保護機制提供了一個新的方向。

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