替米沙坦對糖尿病模型鼠心肌微血管新生的促進(jìn)作用

王小華,殷士良,趙玉萍,劉曉峰,趙春艷,周鳳娟

（河北省唐山市灤縣人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 063700）

糖尿病心肌病變是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,獨(dú)立于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化之外,是以微血管為主要病理改變的心肌病變[1-2]。AT1受體拮抗劑對心臟的保護(hù)作用已被公認(rèn),通過降低心肌中轉(zhuǎn)化生長因子β1等對心肌纖維化起抑制作用,改善心室重構(gòu)。而肝細(xì)胞生長因子（HGF）被認(rèn)為是血管保護(hù)因子,目前越來越受到重視。AT1受體拮抗劑能否通過肝細(xì)胞生長因子對心肌微血管病變起改善作用,目前研究較少。作者通過建立2型糖尿病大鼠模型及替米沙坦干預(yù)作用,探討A T1受體拮抗劑改善糖尿病心肌微血管病變的細(xì)胞因子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,體重（180±20）g,由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.1.2 試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ,Sigma公司）、替米沙坦（美卡素,德國勃林格殷格翰公司）及兔抗大鼠多克隆HGF抗體（武漢博士德公司）等。

1.1.3 儀器 EIO-RAD電泳槽及電泳儀（美國RAD公司）、超薄切片機(jī)（LEICA EM UC6,德國LEICA公司）、透射電子顯微鏡（JEM-1200EX,日本）及心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜厚度觀察采用電鏡下MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)（四川大學(xué)圖像圖形研究所提供）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型的復(fù)制 （1）高糖高脂飼料配方：熟豬油10%、蔗糖20%、膽酸鹽1%、膽固醇2.5%、普通飼料66.5%。其中碳水化合物熱卡占40%,脂肪熱卡占42%,蛋白質(zhì)熱卡占18%；（2）鏈尿佐菌素（STZ）的配制：臨用前10min新鮮配置。以0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.4）在冰浴中新鮮配制成10mg/mL STZ溶液,用無菌濾器過濾后放入事先準(zhǔn)備好的無菌瓶內(nèi)；（3）模型建立方法：高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后空腹15h,尾靜脈一次性注射STZ 30mg/kg；（4）造模成功標(biāo)準(zhǔn)：注射STZ后3、7d測2次非禁食血糖大于或等于16.7mmol/L判斷為2型糖尿病[3]；（5）排除標(biāo)準(zhǔn)：至少1次非禁食血糖小于16.7mmol/L者排除實(shí)驗(yàn),以后每周測1次非禁食血糖,＜16.7mmol/L者及時(shí)排除。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（C組）10只,給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；其余30只給予高糖高脂飼料喂養(yǎng),分為糖尿病模型組（D組）15只,替米沙坦干預(yù)組（T組）15只。C組喂養(yǎng)4周后以按體重計(jì)算的枸櫞酸鹽尾靜脈注射,D、T組給予STZ尾靜脈注射；T組給予替米沙坦8.34mg·kg-1·d-1（相當(dāng)于人80mg/d）溶于1mL水中灌胃,C、D組給予等體積生理鹽水灌胃。各組大鼠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)12周結(jié)束實(shí)驗(yàn),見表1。

表1 大鼠分組情況

表2 各組大鼠生化指標(biāo)及心肌細(xì)胞內(nèi)HGF水平比較（±s）

表2 各組大鼠生化指標(biāo)及心肌細(xì)胞內(nèi)HGF水平比較（±s）

*：與C組比較,P＜0.01；#：與D組比較,P＜0.01。

組別 TG（mmol/L） T C（mmol/L） FBG（mmol/L） FINS（μ IU/mL） IRI HGF C組 0.73±0.05 1.93±0.06 4.66±0.57 20.34±2.06 1.43±0.15 1.00±0.00D組 1.65±0.07* 4.90±0.10* 20.17±1.25* 32.43±3.80* 3.36±0.16* 2.73±0.07*T組 1.29±0.051*# 4.74±0.15* 19.28±1.51* 25.69±3.17*# 3.0±0.11*# 3.59±0.09*#

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測 空腹12h測心功能后自頸動(dòng)脈采血3mL,置于離心管中,3000r/min離心10min,吸出血清置于EP管中,-20℃冰箱中貯存,備測血糖、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、胰島素等。（1）血糖：采用葡萄糖氧化酶法,由BECKM AN全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測。（2）TG：采用甘油磷酸氧化酶法,由BECKMAN全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測。（3）TC：采用酶比色法,由BECKM AN全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測。（4）血清胰島素：采用放射免疫法,嚴(yán)格試劑盒說明書操作：①按順序?qū)⒖俆管、NSB管、“0”管、各標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管擺放好；②分別向NSB管、“0”管內(nèi)加入緩沖液200、100μ L；③向各標(biāo)準(zhǔn)管內(nèi)加入Ins.標(biāo)準(zhǔn)品（S1-S6）100μ L；④向各樣品管內(nèi)加入各樣品100μ L；⑤向每個(gè)管內(nèi)加入125Ins.100μ L；⑥向“0”管、各標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管內(nèi)加入Ins.抗體100μ L；⑦混勻,溫育2h；⑧向除總 T管內(nèi)的每個(gè)管內(nèi)加入驢抗豚免疫分離劑500μ L；⑨充分搖勻后,室溫放置15min,用KDC-2044低速冷凍離心機(jī)4000r/min離心15min；⑩吸棄上清液,用GC-911γ放射免疫計(jì)數(shù)儀測各沉淀管放射性計(jì)數(shù)。用log-logit數(shù)據(jù)處理模式聯(lián)機(jī)處理,得出結(jié)果。批內(nèi)變異系數(shù)為4.2%,批間變異系數(shù)為7.5%。（5）計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（IRI）,IRI=ln（FBG×FISN/22.5）。

1.2.4 心肌中HGF水平檢測 （1）樣品總蛋白提取及濃度測定：用Western blot法測定 TGF-β1及HGF含量,參照《微生物法醫(yī)學(xué)：理論與技術(shù)》的方法[4]。取左室心尖部心肌組織黃豆粒大小,用PBS緩沖液洗凈,剪碎樣本,加入RIPA buffer裂解液覆蓋組織,用勻漿機(jī)勻漿,4℃,12000r/min離心25min,保留上清液,應(yīng)用BCA法,酶標(biāo)分析儀測定各樣品吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品總蛋白濃度；（2）2SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳：加NCIP/NBT顯色后,各樣品均加樣50μ g蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)印至聚偏（二）氟乙烯（Polyvinylidene difluoride,PVDF）膜上,TBS（20mmol/L Tis-HCL,500MmNaCl,pH7.5）、1%BSA封閉2h，TBS洗膜3×5min,加入稀釋的一抗兔抗大鼠HGF多克隆抗體（1∶400）和稀釋的兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（1∶400）,搖床上4℃雜交過夜。TTBS（含0.05%Tween-20的TBS）洗膜3×5min。倒掉洗膜液,分別加入與一抗相對應(yīng)的1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,搖床上雜交1h。取出 PVDF膜,TTBS洗膜2×5min；TBS洗膜 5min。加NCIP/NBT顯色2～5min,待蛋白條帶顯示清晰時(shí),終止反應(yīng),掃描。利用Gene Genius生物圖像凝膠分析儀測定目的蛋白條帶亮度,以β-actin作為內(nèi)參照。并以對照組樣品條帶亮度為100%,計(jì)算出各樣品的相對值作為各蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 心肌超微結(jié)構(gòu)觀察 取左心室心尖部位心肌組織用3%戊二醛和1%鋨酸固定,乙醇逐級脫水,丙酮浸透,環(huán)氧樹脂包埋,切成1μ m半薄切片,用醋酸鈾初染,枸櫞酸鉛復(fù)染,于電子顯微鏡下觀察不同組同一部位心肌微血管的超微結(jié)構(gòu)變化,并測定心臟細(xì)胞表面積及毛細(xì)血管細(xì)胞基底膜厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示,多組間采用單因素方差分析One-way Anova,兩兩比較用LSD檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對糖尿病大鼠生化指標(biāo)及心肌細(xì)胞內(nèi)HGF水平的影響 與C組比較,D、T組空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（IRI）、TC、TG、HGF蛋白含量均升高；與D組比較,T組FINS、IRI、TG均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,FBG、TC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HGF蛋白含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,見表2。

2.2 電鏡下心肌病理學(xué)改變 C組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞扁平光滑,管腔不狹窄,基底膜正常。D組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核腫脹向管腔突出,血管壁內(nèi)膜凹凸不平,管腔狹窄,基底膜增厚,斷裂模糊。T組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核輕度腫脹,管腔狹窄較D組輕,基底膜較清晰,無斷裂。與C組比較,D、T組心肌細(xì)胞表面積和心臟血管細(xì)胞基底膜厚度增加,與D組比較,T組心肌細(xì)胞表面積和心臟血管細(xì)胞基底膜厚度減少,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3。

表3 各組心肌病理學(xué)改變（±s）

表3 各組心肌病理學(xué)改變（±s）

*：與C組比較,P＜0.05；#：與D組比較,P＜0.05。

組別 心臟細(xì)胞表面積 心臟血管細(xì)胞基底膜厚度C組 343.30±36.63 3.63±0.45D組 474.88±49.39* 5.19±0.48*T組 421.77±33.47*# 4.62±0.43*#

3 討論

2型糖尿病模型制備比較常見的是高糖高脂飲食或高脂飲食加以小劑量STZ腹腔或尾靜脈注射[2]。通過飲食造成高脂高胰島素血癥,然后注射小劑量STZ破壞胰島β細(xì)胞功能,使其發(fā)生高血糖,類似于2型糖尿病發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)參照招少楓等[3]的方法先給予高糖高脂飲食 4周,然后給予 STZ 30mg/kg尾靜脈一次性注射,經(jīng)STZ注射后1周末測體重和血糖,D、T組明顯高于C組,成功建立了2型糖尿病SD大鼠模型。STZ是一種抗癌藥物,15～40mg/kg STZ對正常大鼠胰島功能破壞小,一般不造成血糖升高。實(shí)驗(yàn)中給予 STZ 30mg/kg尾靜脈一次性注射,較腹腔注射穩(wěn)定,成模總有效率為73.3%。本實(shí)驗(yàn)每周檢測血糖1次,隨時(shí)排除血糖不符合標(biāo)準(zhǔn)者,保證血糖直到實(shí)驗(yàn)?zāi)┻_(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、TC、TG等指標(biāo)D、T組與C組比較均有明顯差異,符合高糖、高脂、高胰島素血癥的2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)。

糖尿病心肌病變主要以微血管病變?yōu)橹?其發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚,可能與心肌細(xì)胞能量代謝紊亂、細(xì)胞功能改變、凋亡增加、細(xì)胞因子的異常表達(dá)有關(guān)。心肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝取及氧化障礙導(dǎo)致脂肪酸氧化增加,其代謝產(chǎn)物積聚引起細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)活性抑制。由于長期代謝紊亂,血液動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)等方面的改變引起心肌微血管病變。心肌微血管管壁增厚,管腔狹窄,心肌可發(fā)生廣泛的缺血、變性、壞死和纖維化等。本研究結(jié)果顯示毛細(xì)血管基底膜增厚、管腔狹窄、心肌細(xì)胞腫脹均是心肌細(xì)胞代謝障礙的結(jié)果,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。

近年來HGF對心血管的保護(hù)作用已倍受關(guān)注。HGF在肝臟大量合成,并分泌入血液循環(huán)中。HGF在許多靶器官包括心臟和血管中具有多種生物學(xué)作用,能促進(jìn)細(xì)胞分裂、遷移以及形態(tài)的發(fā)生,是形成、維持及重塑多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的重要血管營養(yǎng)因子。本研究結(jié)果顯示替米沙坦增加心肌中HGF表達(dá),這與Nakano等[6]研究發(fā)現(xiàn)利用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體-1阻斷劑治療6周后,心臟、血管局部HGF含量明顯上升的結(jié)果一致。

替米沙坦是一種新型的AT1受體拮抗劑,其對心肌微血管結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用可能與下列機(jī)制有關(guān)：（1）選擇性激動(dòng)PPARγ。有研究表明替米沙坦能在治療劑量下選擇性激動(dòng)PPARγ[7]。當(dāng)PPARγ被激活后脂聯(lián)素（APN）表達(dá)則明顯增加；同時(shí)血管緊張素受體阻滯劑（ARBs）還能抑制細(xì)胞內(nèi)APN降解,使 APN含量增加,從而起到調(diào)節(jié)代謝、改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性的作用,減少由于代謝紊亂對心肌結(jié)構(gòu)的損害。同時(shí)發(fā)現(xiàn)可以通過PPARγ途徑下調(diào)A T1表達(dá),進(jìn)一步對心肌起保護(hù)作用[8]。（2）升高心肌中HGF表達(dá)。有研究顯示AT1受體拮抗劑可降低心肌局部AgⅡ表達(dá)[9],而AgⅡ?yàn)镠GF抑制劑,從而升高心肌中HGF表達(dá)。本研究結(jié)果顯示替米沙坦升高心肌中 HGF表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。HGF通過抗凋亡、促血管新生、修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞等對心肌具有保護(hù)作用。其機(jī)制可能與 HGF負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和AgⅡ有關(guān)。總之,替米沙坦能夠改善糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu),可能與升高心肌中HGF表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究如何升高心肌中 HGF表達(dá)將成為治療糖尿病心肌病變的新思路。

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