茶多酚對ACC-M細胞株Fas、Fasl表達的影響*

李 萍,楊志剛,文國容,魏 丹,宋 琦

（遵義醫學院附屬口腔醫院,貴州563003）

茶多酚是茶葉最主要組成成分,也是茶葉的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、清除自由基、抗腫瘤等多種生物學活性和藥理功能。茶多酚抗腫瘤作用的機制多集中于胃癌、大腸癌、肝癌的研究,對口腔腫瘤的研究較少,特別是茶多酚對具有明顯侵襲性的口腔腺樣囊性癌生長的研究少見。Fas屬于腫瘤壞死因子及神經生長因子受體家族成員,是細胞凋亡信號受體,與其配體Fasl結合,在腫瘤凋亡及腫瘤免疫方面起重要作用。本文采用體外試驗研究茶多酚對肺高轉移性腺樣囊性癌細胞株（adenoid cystic carcinoma cell clones highly metastatic to the lung,ACC-M）生長以及Fas及其配體Fasl表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 ACC-M（中科院上海細胞庫）,RPMI1640培養液（Sigma,美國）,鼠抗人Fas、Fasl、S-P染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）,MTT試劑（北京華美生物工程公司）,全自動酶標檢測儀（BIO-TEK,美國）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 ACC-M復蘇后于10%小牛血清的RPMI1640培養液、5%CO2飽和濕度、恒溫37℃條件下培養,按1∶3細胞比例傳代,選擇對數生長期細胞進行試驗。

1.2.2 茶多酚對ACC-M生長的影響（M TT法） 將對數期細胞調整至5×104個,接種于96孔板,5%CO2、37℃、孵育24h,細胞單層鋪滿孔底,加入0.00、0.05、0.1、0.15、0.2g/L濃度茶多酚,5%CO2,37℃培養,分別于24、48、72h時間段觀察細胞形態,并棄上清液,加入0.5%M TT 20μ L,培養4h,加入150μ L二甲基亞砜（DMSO）,用酶聯免疫檢測儀（測定波長490nm）測定各孔吸光密度值（optical delnsity,OD值）,記錄結果。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.3 免疫組化（SP法） 將對數期生長的ACC-M細胞胰酶消化,制成細胞懸液,以每孔約5×104個細胞接種于6孔板內蓋玻片上,在5%CO2飽和濕度、恒溫37℃培養箱中培養24h后加入0.00、0.05、0.1、0.15、0.2g/L濃度茶多酚。用PBS液沖洗,4%多聚甲醛室溫固定,操作方法嚴格按照SP試劑盒說明進行。鼠抗人Fas濃度為1∶40,鼠抗人Fasl濃度為1∶100。

1.2.4 判定標準 陽性細胞必須具備：（1）細胞結構清晰；（2）陽性棕黃色顆粒定位于細胞膜或細胞漿；（3）著色明顯高于背景；（4）采用 PBS代替一抗為空白對照組。用Image-proplus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析,計算平均OD,然后求視野平均值作為該標本的表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析,實驗結果以±s表示,組間差異比較采用ANOVA單因素方差分析檢驗法,以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 不同濃度茶多酚對ACC-M細胞作用后OD值及抑制率比較（±s）

表1 不同濃度茶多酚對ACC-M細胞作用后OD值及抑制率比較（±s）

*：與同期對照組比較,P＜0.05；#：與24h同濃度組比較,P＜0.05。-：表示無此項。

濃度（g/L）24h OD值 抑制率（%）48h OD值 抑制率（%）72h OD值 抑制率（%）0.00 0.441±0.024 - 0.586±0.095 - 0.654±0.028 -0.05 0.369±0.032 16.5 0.474±0.007*# 19.1 0.519±0.014*# 20.60.10 0.351±0.019 20.5 0.343±0.032*# 40.8 0.337±0.021*# 48.10.15 0.332±0.170* 24.9 0.249±0.114*# 57.5 0.231±0.072*# 64.70.20 0.316±0.038* 28.3 0.229±0.008*# 60.9 0.217±0.010*# 66.8

2 結果

2.1 細胞形態 未經茶多酚處理的ACC-M細胞融合致密成單層,呈鵝卵石樣鑲嵌排列,細胞間連接緊密,細胞呈多邊形,界清,胞漿豐富,并可見多個處于分裂相的細胞。經不同濃度茶多酚處理后,細胞呈不規則狀,細胞間隙增大,細胞數量、分裂相細胞數目減少,細胞內空泡形成,尤以0.2g/L茶多酚處理72h后明顯。

2.2 細胞抑制率 茶多酚對ACC-M細胞生長抑制隨濃度增加,抑制作用逐漸明顯,差異有統計學意義（P＜0.05）,同時隨茶多酚作用時間逐漸延長,抑制細胞生長亦越明顯,差異有統計學意義（P＜0.05）,見表1。

2.3 Fas、Fasl在ACC-M細胞的表達 對照組Fas蛋白在ACC-M細胞胞漿中微弱甚至無陽性染色；經不同濃度茶多酚作用后ACC-M細胞胞漿可見棕黃色顆粒,彌漫分布于胞漿沿核膜周邊,0.05、0.1、0.15、0.2g/L茶多酚作用組表達明顯高于對照組,差異有統計學意義,見插頁Ⅰ彩圖4。對照組Fasl蛋白在ACC-M細胞胞膜、胞漿中有明顯棕黃色染色,其細胞形態正常；經不同濃度茶多酚作用后ACC-M細胞在胞膜、胞漿內仍可見陽性表達,但數量明顯減少,且陽性程度減弱,0. 05、0.1、0.15、0.2g/L茶多酚作用組明顯低于對照組,差異有統計學意義,見插頁Ⅰ彩圖5。

3 討論

茶多酚是茶葉的主要活性成分,由茶葉提取物兒茶素、黃酮類、酚酸類、花色素等30多種物質組成,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、清除自由基、抗腫瘤等多種生物學活性和藥理功能,茶多酚對多種腫瘤生長具有明顯抑制作用,不僅可抑制腫瘤形成,還可以減少已形成腫瘤的數量、大小。Hwang等[1]發現茶多酚主要活性成分——沒食子兒茶素、沒食子酸酯可通過抑制COX-2表達、誘導細胞凋亡、調節細胞周期調節蛋白表達等多個途徑發揮抗大腸癌作用。韓麗娟[2]的實驗證明沒食子兒茶素、沒食子酸酯可抑制人卵巢癌C0C1細胞株增殖,延長細胞增殖周期,誘導細胞凋亡。杜春華等[3]發現茶多酚使人肺癌細胞株SPC-AI細胞周期阻滯于G0期,抑制肺癌細胞增殖。本實驗結果顯示在茶多酚作用后ACC-M細胞形態、數量發生改變,細胞數量減少,細胞間隙增大,分裂相細胞數目減少,細胞內空泡形成。同時,各時間段實驗組與對照組比較,增殖活性明顯下降,差異有統計學意義（P＜0.05）；而在同一濃度的茶多酚作用下,隨著時間延長,ACC-M細胞增殖能力也逐漸下降,72h組較24、48h組的ACC-M細胞存活率明顯下降,差異有統計學意義（P＜0.05）。表明0.05～0.2g/L茶多酚可抑制ACC-M細胞增殖,并有明顯量效和時效依賴關系。茶多酚主要可能通過以下幾種方式抑制腫瘤生長：（1）抑制腫瘤細胞DNA復制,一方面茶多酚通過影響修復系統促進DNA損傷的修復,并通過與DNA聚合酶相互作用而增加DNA復制的準確性；另一方面還可以通過抑制DNA拓撲異構酶和抑制與DNA合成有關的酶與DNA結合而抑制腫瘤細胞DNA復制,從而抑制腫瘤生長。（2）阻滯腫瘤細胞進入細胞周期,茶多酚可使腫瘤細胞分裂相明顯減少,細胞增殖受到抑制,生存率下降；S期細胞明顯減少,G0/G1細胞所占比率增加,細胞出現G1/S阻滯。

Fas系統在細胞凋亡的信號轉導過程中具有重要作用，Fas屬Ⅰ型跨膜蛋白,是腫瘤壞死因子超家族成員,當膜表面Fas蛋白與其配體Fasl結合后,導致Fas空間構象改變,引起死亡誘導信號復合體形成,進而激活caspase-8,啟動蛋白級聯反應,誘導攜帶Fas細胞凋亡,這是細胞凋亡的主要途徑之一[4]。本研究發現隨著茶多酚濃度增加,ACC-M細胞中Fas蛋白表達逐漸增多,明顯高于對照組,差異有統計學意義（P＜0.05）,并且Fas蛋白表達隨著茶多酚濃度遞增而逐漸增強；同時不同濃度茶多酚作用后,ACC-M細胞中Fasl蛋白表達低于對照組,差異有統計學意義（P＜0.05）,并且Fasl蛋白表達隨著茶多酚濃度遞增而逐漸降低,尤其是胞漿中表達明顯減少。說明茶多酚引起ACC-M細胞凋亡的機制可能與Fas/Fasl途徑有關,可能是通過上調Fas,下降Fasl,啟動Fas/Fasl介導的細胞凋亡通路。腫瘤細胞表達Fasl蛋白還可誘導其周圍Fas陽性表達的淋巴細胞與之結合,導致腫瘤內淋巴細胞凋亡,得以逃避免疫系統的監視和攻擊,腫瘤細胞凋亡受到抑制[5]。同時,作者認為茶多酚還可使ACC-M腫瘤細胞Fas表達增高，Fasl表達降低,使腫瘤周圍Fasl陽性表達的淋巴細胞與之結合,啟動機體免疫系統的監視和攻擊,促進腫瘤細胞凋亡。

但茶多酚并不能完全抑制ACC-M細胞活力,即使茶多酚濃度達到0.2g/L,細胞仍有部分存活,這可能是因為在ACCM細胞中除Fas/Fasl凋亡途徑外,還可能存在其他信號轉導途徑,這是一個復雜的信號網絡系統[6]。因此茶多酚抗腫瘤作用的分子機制與其他信號通路之間的關系還需進一步研究。

[1]Hwang JT,Ha J,Park IJ,et a1.Apoptotic effect of EGCG in HT-29colon cancer cells via AM PK signal pathway [J].Cancer Lett,2007,247（1）：115.

[2]韓麗娟.表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制人卵巢癌CoCl細胞生長[J].長治醫學院學報,2008,22（5）：333.

[3]杜春華,成煒,胡曉玲,等.茶多酚對肺癌SPC A1細胞增殖的影響[J].山東醫藥,2007,47（31）：1.

[4]Baskin-Bey ES,Gores GJ.Caspase-8,death-receptor signaling,and hepatocarcinogenesis：the Fas and the furious [J].Gastroenterol,2005,129（5）：1790.

[5]徐銀祥,蔣耀光,林一丹,等.非小細胞肺癌fas異常表達與腫瘤浸潤性淋巴細胞凋亡的關系[J].重慶醫學,2007，36（5）：441.

[6]Yu C,Friday BB,Lai JP,et al.Cytotoxic synergy between the multikinase inhibitor sorafenib and the proteasome inhibitor bortezomib in vitro：induction of apoptosis through Akt and c-Jun NH2-terminal kinase pathways[J].Mol Cancer Ther,2006,5（9）：2378.