大鼠子宮內膜異位癥CD44的異常表達及意義

金海燕，周龍書

（廣州醫學院第二附屬醫院，廣州 510260）

具有活性的子宮內膜組織出現在子宮內膜以外部位時稱為子宮內膜異位癥（Endometriosis,EMT），簡稱內異癥。根據子宮內膜種植學說，經血中所含的子宮內膜碎片可隨經血倒流，經輸卵管進入腹腔，種植于卵巢和臨近的盆腔腹膜，以致形成EMT[1]。腹膜表面覆蓋著一層間皮細胞，可以分泌大量透明質酸乃至在間皮細胞周圍形成一層包被，CD44正是透明質酸的受體，與細胞外基質中的透明質酸結合，參與子宮內膜細胞與腹膜之間的特異性黏附[2]。因此，本研究建立大鼠EMT模型，比較黏附分子CD44在EMT大鼠在位、異位內膜及正常子宮內膜中的表達，以探討CD44在EMT發病中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 大鼠EMT模型的建立

健康雌性SD大鼠，體重200～240 g。經陰道涂片檢查，在動情期建模。以2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔麻醉。在尿道上端約 1 cm 處，沿腹部中線切開皮膚約3 cm，切下左側子宮角長約1.5 cm，并行端端吻合術。在洛氏營養液中，將切下的子宮角縱向剖開，并將其內膜與肌層分離，切取5 mm×5 mm的內膜片段，令其表面上皮與腹壁相對，用無損傷6-0縫線將其四角縫于腹腔右側腹壁上。縫合切口，常規飼養。對照組（假手術組）術程同建模組，只是不予縫合內膜片段于腹壁。

1.2 試驗分組

建模組：建模后第4周，選擇動情期，將建模成功的10只大鼠，摘出在位及異位子宮內膜組織。對照組（假手術組）：5只大鼠，于假手術后第4周，選擇大鼠動情期，摘出子宮內膜組織。

1.3 免疫組織化學方法檢測EMT組在位、異位內膜及對照組子宮內膜CD44的表達

標本進行石蠟包埋、切片，經微波爐抗原修復20 min后用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶（S-P）法進行染色。采用DAB同步浸染顯色法使所有切片顯色時間相同[3]。試驗設陽性對照及陰性對照。小鼠抗大鼠CD44（購自深圳先進技術工業有限公司）；S-P免疫組化通用試劑盒（購自Maxin Biotech公司），均為即用型。

1.4 圖像分析

用陽性單位（Positive unit，PU）定量表達免疫組化陽性反應程度。將排除了切片本底因素后的純免疫組化反應程度按灰度圖像分為0～100個等級，每一個等級定義為1個PU。PU值大小與陽性反應程度成正比。在Leica Q550 IW圖像分析系統上測試大鼠在位和異位子宮內膜腺上皮的灰度值Gα和背景的灰度值Gβ，按公式PU=[（Gα-Gβ）/Gmax]×100計算PU值。Gmax為檢測儀器的最大灰度，等于256。每張染色片隨機測試10個視場，相加后除以10，所得數值為該切片的陽性單位[4]。

1.5 統計學分析

用SPSS 10.0統計軟件進行統計學分析。所有數據均用±S表示，EMT大鼠在位子宮內膜、異位內膜和對照組子宮內膜腺上皮之間的比較采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 大鼠EMT模型的形態學

大鼠EMT模型建模后第4周開腹，見移植的異位子宮內膜體積明顯增大，生長良好，形成內有液體積聚表面有血管攀生的透明小囊泡，移植物組織學檢查可見子宮內膜上皮細胞、腺體及間質細胞，證明建模成功。對照組大鼠假手術后第4周，未見移植物生長。

2.2 大鼠EMT模型異位內膜的超微結構

大鼠EMT模型異位的腺上皮很少見腺腔形成。分泌細胞游離面有短小稀疏的微絨毛，可見分泌細胞的微絨毛大片脫落（見圖1）。纖毛細胞表面的纖毛短小、少見（見圖2）。上皮細胞間隙囊狀擴大，胞漿內線粒體體積增大，擴張呈球形，中央可見透亮無嵴區；還有少量粗面內質網、豐富的游離核糖體和高爾基體。細胞核位于細胞中部，核周腔擴大；核膜不規則；核染色淡，染色質分散，核仁明顯。異位內膜腺上皮細胞可見凋亡現象，基底膜彎曲，間質細胞體積大，核染色稍淡。

圖1 大鼠EMT模型異位的腺上皮分泌細胞的微絨毛大片脫落（×6890）Fig.1 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the microvilli on the free surface of secretory cells had shed(Original magnification:×6890)

圖2 大鼠EMT模型異位的腺上皮纖毛細胞表面的纖毛短小（×5200）Fig.2 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the cilia of ciliated cells were short（Original magnification:×5200）

2.3 大鼠EMT模型組在位、異位內膜與對照組子宮內膜CD44的表達模式

CD44在大鼠子宮內膜的腺上皮細胞、腔面上皮細胞表達。CD44陽性細胞的細胞膜被染成棕黃色，胞漿內雖也有CD44表達，但著色比胞膜淺，一些腺體的腺腔內也充滿了CD44陽性顆粒。大鼠EMT模型組在位、異位內膜與對照組子宮內膜CD44的表達模式見表1。

表1 大鼠EMT模型子宮內膜腺上皮CD44的表達Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

表1 大鼠EMT模型子宮內膜腺上皮CD44的表達Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

注：組間比較，數據肩標不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）；不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同且大小寫也相同表示差異不顯著（P＞0.05）。Note:To compare between the groups,values with different capital letters mean extremely significant difference(P＜0.01).Values with different small letters mean significant difference(P＜0.05).The same letters mean no significant difference(P＞0.05).

組別Group n CD44 對照組大鼠子宮內膜Endometrium from control rats 1 5 6.97±2.13Aa大鼠EMT模型組在位內膜Eutopic endometrium from rats with endometriosis 2 10 7.20±1.68Aa大鼠EMT模型組異位內膜Ectopic endometrium from rats with endometriosis 3 10 19.34±2.35Bb

由表1可以看出，大鼠EMT模型組在位內膜腺上皮CD44的表達（見圖3）與對照組子宮內膜（見圖4）無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 大鼠EMT模型組在位內膜CD44的表達（×400）Fig.3 Expression of CD44 in eutopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

圖4 對照組大鼠子宮內膜CD44的表達（×400）Fig.4 Expression of CD44 in endometrium from control rats(S-P×400)

EMT模型組大鼠異位內膜腺上皮CD44的表達（見圖5）高于對照組子宮內膜，差異極顯著（P＜0.01）。EMT模型組大鼠異位內膜腺上皮CD44的表達高于同組的在位內膜，差異極顯著（P＜0.01）。其中對照組大鼠子宮內膜CD44的PU平均值為6.97，大鼠EMT模型組在位內膜CD44的PU平均值為7.20，而大鼠EMT模型組異位內膜CD44的PU平均值為19.34。

圖5 大鼠EMT模型組異位內膜CD44的表達（×400）Fig.5 Expression of CD44 in ectopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

3 討 論

正常生理狀態下，子宮內膜生長于子宮腔內壁，受卵巢激素調控，每月隨月經來潮而剝脫后排出體外。當子宮內膜組織出現在子宮體以外部位時，稱為EMT。EMT雖然是一種良性疾病，但生物學行為卻如同惡性腫瘤，具有浸潤破壞性和復發性等，使之成為難以治愈、危害頗大生殖系統疾病之一。居于子宮腔內的子宮內膜如何遷徙到機體的其他部位形成EMT，確切病因及發病機制至今尚不明確，且病程呈進行性加重，長期以來令人困惑。根據子宮內膜種植學說，逆流經血中的子宮內膜與腹膜接觸并種植在其表面是形成EMT的主要途徑。

CD44是一種細胞表面跨膜糖蛋白，通過細胞膜外受體與相應配體如透明質酸、膠原蛋白、纖粘蛋白、層粘蛋白等基質分子結合后，參與細胞－細胞、細胞－基質之間的特異性粘連，并與細胞骨架蛋白結合，參與細胞偽足形成，與細胞的遷移運動有關。

研究發現，子宮內膜在盆腹腔突破腹膜及器官“防線”，在“異域”生根、生長，必須經過粘附（Adhesion）－侵襲（Aggression）－血管生成（Angiogenesis）三部曲。子宮內膜細胞在盆、腹腔內與間皮細胞接觸是形成異位病灶的第一步[5]。腹膜表面覆蓋著一層間皮細胞，可以分泌大量透明質酸，CD44正是透明質酸的受體。CD44的表達增加，使脫落的細胞易于通過其配體透明質酸與腹膜表面的間皮細胞結合，并形成種植灶。由此可見，CD44表現出許多浸潤和轉移所需要的特性，它的異常表達可能與EMT的發生和轉移有密切的關系。CD44在子宮內膜細胞與間皮細胞的相互作用中發揮非常重要的作用[6－7]。

本研究通過建立大鼠EMT模型，發現EMT模型大鼠異位內膜腺上皮CD44的表達顯著高于EMT在位內膜及對照組子宮內膜。由腹膜間皮細胞產生的透明質酸與表達CD44的子宮內膜細胞黏附結合，是子宮內膜細胞在盆、腹腔種植形成EMT的機制之一，CD44表達增強的子宮內膜細胞表現出與間皮細胞很強的黏附性。CD44表達增強的子宮內膜腺上皮細胞是具有腹膜種植潛能的細胞，易與細胞外基質黏附，進而在異位處種植生長，種植能力與CD44的表達量有關，其在異位內膜中的異常表達可引起異位病灶的種植。

[1]樂杰.婦產科學[M].7版.北京:人民衛生出版社,2008:325-332.

[2]Griffith J S,Liu Y G,Tekmal R R,et al.Menstrual endometrial cells from women with endometriosis demonstrate increased adherence to peritoneal cells and increased expression of CD44splice variants[J].Fertil Steril,2010,93(6):1745-1749.

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