紫杉醇對(duì)食蟹猴和人CYP1A2、CYP3A4及CYP2A6酶代謝的影響

耿祥飛，張廣州，任 娟，王立娜，賈麗娟，沈國(guó)林，劉鴻君

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；3.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088；4.北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司，北京 101111）

藥物相互作用是兩種或兩種以上藥物聯(lián)合使用時(shí)有時(shí)可能會(huì)對(duì)療效產(chǎn)生一定的影響，也可能產(chǎn)生不良反應(yīng)。隨著中藥在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用，中藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用的情況越來(lái)越多。然而人們對(duì)中藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用的后果了解很少，這在一定程度上增加了中藥與西藥聯(lián)合用藥的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞色素CYP450酶在藥物代謝中起著重要的作用，是產(chǎn)生藥物相互作用最重要的途徑之一。CYP1A2酶在肝組織中有特異性表達(dá)［1］，是重要的細(xì)胞CYP450酶之一，約占肝臟總的CYP450氧化酶含量的13％，而且CYP1A2酶參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化，從而誘發(fā)基因突變或抑制一些基因的表達(dá)，造成細(xì)胞損害或誘導(dǎo)凋亡，甚至發(fā)生腫瘤。CYP2A6是CYP2A亞家族重要成員之一，約占整個(gè)CYP450酶系統(tǒng)的5％，對(duì)很多藥物和環(huán)境中化合物的清除起重要作用，參與許多藥物代謝，還可激活許多結(jié)構(gòu)上非相關(guān)的前致癌物［2］，比如它能將許多致癌原如黃曲酶毒素B1、煙草中大量的亞硝胺致癌原激活為強(qiáng)致癌物，N-亞硝基二甲胺激活為強(qiáng)致癌物則與肺癌罹患率顯著相關(guān)［3，4］。CYP3A酶是其中最重要的，其含量占人肝CYP的30％［5］，參與了臨床上約50％藥物的代謝［6］，對(duì)CYP3A活性的影響將導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物相互作用［7］。非那西汀、香豆素和睪丸酮是特異性的CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶的底物，通過建立相應(yīng)的HPLC檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確測(cè)定三種底物相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，為研究紫杉醇對(duì)CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶活性的影響提供一定的基礎(chǔ)。

食蟹猴在形態(tài)學(xué)、生殖生理特性和生化代謝方面與人類非常相似，在遺傳物質(zhì)上也與人類有98％左右的同源性，因此，應(yīng)用食蟹猴進(jìn)行研究的結(jié)果最容易推廣于人類，早已被作為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各領(lǐng)域研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：6-磷酸葡萄糖（Sigma公司）、氧化型輔酶Ⅱ（北京縱橫洋洲公司），6β羥基睪丸酮（Sigma公司），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（北京縱橫洋洲公司），睪丸酮，非那西丁，香豆素（Sigma公司），甲醇、乙腈（色譜純）均購(gòu)自天津四友試劑公司，高純水，肝微粒體（匯智泰康公司）。

1.1.2 儀器：Agilent高效液相色譜、Sigma高速離心機(jī)（Sigma公司）、MDF-U50V超低溫冰箱（-80℃）、超凈工作臺(tái)、全自動(dòng)高壓鍋（日本三洋公司）、微型旋渦混合儀QL-901（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）、電熱恒溫水浴箱BHW-2（北京醫(yī)療設(shè)備廠）、移液槍、量筒、燒杯、SHZШ型水循環(huán)真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、抽濾器（北京八方公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：來(lái)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心人工飼養(yǎng)的食蟹猴［SCXK-（軍）2007-004］，常規(guī)飼養(yǎng)觀察無(wú)異常表現(xiàn)，心、肝、腎等重要器官血液生化指標(biāo)檢測(cè)正常。

1.2 方法

1.2.1 肝微粒體混合酶系配制：肝微粒體0.5mg/mL，3.3mmol/L MgCl2，3.3mmol/L 6-磷酸葡萄糖，1.3mmol/L氧化型輔酶Ⅱ，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（0.4μ/mL），0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=7.4）定容到250mL，混合酶系配制均在冰浴上進(jìn)行。

1.2.2 供試品配制：精密稱取紫杉醇341.6mg，用10mL乙睛超聲溶解，加入到孵育系統(tǒng)的終濃度為400μmol/L，配制成7個(gè)濃度400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L。

1.2.3 睪丸酮、非那西丁和香豆素體外代謝方法：體外代謝的孵育體系按照（1.2.1）配制，每管0.25mL孵育體系中加入200μmol/L底物2.5μL，同時(shí)加入不同濃度的紫杉醇，在對(duì)照組中加入溶媒以消除實(shí)驗(yàn)誤差，加完之后輕微混勻，每水平平行3個(gè)管，將反應(yīng)管放入37℃恒溫水浴中孵育。

1.2.4 樣品處理方法：將反應(yīng)管放入37℃恒溫水浴中孵育30min后，取出加入0.25mL冰冷乙腈終止反應(yīng)，放入4℃冰箱保存1h使蛋白沉淀，3000r/min離心10min，然后加入到內(nèi)襯管中10000r/min離心5min，10μL進(jìn)樣于HPLC中進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 代謝產(chǎn)物的檢測(cè)：色譜條件，撲熱息痛：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動(dòng)相：流動(dòng)相A：100％（0.1％醋酸）水，流動(dòng)相B：100％甲醇，梯度洗脫：0min：90％A和10％B，6min：80％A和20％B，6.1min：100％B，8min：100％B，8.1min：90％A和10％B，最終時(shí)間13min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)245nm；7-羥基香豆素：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動(dòng)相：流動(dòng)相A：100％（1％醋酸）水，流動(dòng)相B：100％甲醇，等度洗脫，A∶B=35∶65，最終時(shí)間13min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)320nm；6β羥基睪丸酮：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動(dòng)相：流動(dòng)相A：100％水，流動(dòng)相B：100％甲醇，梯度洗脫：0min：48％A和52％B，8min：38％A和62％B，10min：100％B，10.1min：48％A和52％B，最終時(shí)間15min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)254nm。

1.2.6 計(jì)算方法：Km和Vmax計(jì)算，根據(jù)Lineweaver Burk方程［8］1/v=Km/Vmax×1/［s］+1/Vmax，v為反應(yīng)速度，通過代謝產(chǎn)物量與代謝時(shí)間和蛋白濃度的比值求得，s為底物濃度，Km為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，Vmax為最大反應(yīng)速度，用1/v對(duì)1/s線性回歸，通過EXCEL作圖即可得到一條直線方程，斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax；IC50計(jì)算［9］，通過與中藥成分共同孵育可以得到相應(yīng)的代謝產(chǎn)量，與未加中藥成分的對(duì)照組比較，可以得到相應(yīng)的相對(duì)代謝率，也可以求得相應(yīng)的相對(duì)抑制率，通過中藥成分各濃度與代謝抑制百分率進(jìn)行線性回歸可以求得IC50值，若IC50＞50μmol/L，說(shuō)明藥物對(duì)該CYP450抑制能力弱，IC50＜1μmol/L，說(shuō)明藥物對(duì)該CYP450抑制能力強(qiáng)，有必要獲得抑制常數(shù)Ki。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對(duì)食蟹猴CYP1A2、3A4和2A6酶代謝活性的影響

紫杉醇對(duì)食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性有一定的抑制作用，IC50值分別為570±5.9μmol/L、140±2.9μmol/L和沒有影響無(wú)法計(jì)算，說(shuō)明紫杉醇對(duì)不同CYP450酶的抑制作用都較弱，對(duì)CYP2A6酶活性幾乎沒有影響（表1）。

表1 紫杉醇對(duì)食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響（n=3）Tab.1 The effect of paclitaxel on Cynomolgus monkey CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

表2 紫杉醇對(duì)人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響（n=3）Tab.2 The effect of paclitaxel on human CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

2.2 紫杉醇對(duì)人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響

紫杉醇對(duì)人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性有一定的抑制作用，IC50值分別為193±6.6μmol/L、253±3.6μmol/L和24±1.6μmol/L，說(shuō)明紫杉醇對(duì)不同CYP450酶的抑制作用有較大差異，對(duì)CYP2A6酶的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)CYP1A2和CYP3A4酶活性的影響也較弱（表2）。

3 結(jié)論

紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。通過Ⅱ-Ⅲ臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。紫杉醇是一種具有可開發(fā)前景的抗癌藥物，所以對(duì)其在臨床上使用是否有可能產(chǎn)生藥物相互作用非常重要，有助于評(píng)價(jià)紫杉醇的安全性，指導(dǎo)臨床合理聯(lián)合用藥。本實(shí)驗(yàn)通過以非那西丁、睪丸酮和香豆素為探針?biāo)幬镅芯孔仙即紝?duì)食蟹猴和人肝微粒體CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三種酶代謝的影響。了解紫杉醇對(duì)CYP450酶系的誘導(dǎo)或抑制作用，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥。本文結(jié)果認(rèn)為紫杉醇對(duì)不同種屬肝微粒體CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三種酶的活性沒有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人肝微粒體CYP2A6酶活性具有一定強(qiáng)度的抑制作用而對(duì)其他兩種無(wú)較強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明紫杉醇與上述酶作為底物的藥物聯(lián)合用藥產(chǎn)生藥物相互作用的幾率很小，可以進(jìn)一步證明紫杉醇作為一種抗癌發(fā)展?jié)摿^大的藥物在臨床使用的安全性。

［1］胡云珍，姚彤偉.細(xì)胞色素P4501A的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（4）：246.

［2］Oscarson M，Gullsten H，Rautio A，et al.Geno typing of human cytochrome P4502A6（CYP2A6），a nicotine C-oxidase［J］.FEBSLett，1998，438：201-205.

［3］Fujita K，Kamataki T.Screening of organosulfur compounds as inhibitors of human CYP2A6［J］.Drug Metab Dispos，2001，29（7）：983-989.

［4］Ariyoshi N，Miyamoto M，Umetsu Y，et al.Genetic polymorphism of CYP2A6 gene and tobacco-induced lung cancer risk in male smokers［J］.Cancer Epideiol Biomarkers Prevention，2002，11（9）：890-917.

［5］Shimada T，Yamazaki H，Mimura M，et al.Interindividual variations in human liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs，carcinogens and toxic chemicals：studies with liver microsomes of 30 japanese and 30 Caucasians［J］.J Phamacol Exp Ther，1994，270：414-423.

［6］Smith DA，Jones BC.Speculations on the substrate structureactivity relationship（SSAR）of cytochrome P450 enzymes［J］.BIochem Pharmacol，1992，44：2089-2098.

［7］Thummel KE，Wilkinson GR.In vitroand in vivodrug interactions involving human CYP3A［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1998，38：389-430.

［8］Guengerich FP.Comparisons on catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily enzymes from different species［J］.Chem-Biol Interact，1997，106（3）：161-182.

［9］Nedeleheva V，Gut I.P450 in the rat and man：methods of investigation，substrate specificities and relevance to cancer［J］.Xenobiotica，1994，24（12）：1151-1175.