C57-ras致癌性轉基因小鼠模型的臟器及血液學參數(shù)

左 琴，李 波，岳秉飛，范昌發(fā)

（中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心，北京 100050）

實驗動物的血液生理生化、臟器重量和臟器系數(shù)等特性參數(shù)，是現(xiàn)代實驗動物科學的一項重要內容，是探討疾病發(fā)生機制、生理學、藥理學、毒理學等實驗研究的重要參考值。動物的血液生理生化、臟器和臟器系數(shù)等參數(shù)不僅受其年齡，性別、生理狀態(tài)、生活環(huán)境和營養(yǎng)水平的影響，也受動物的種類、品系、遺傳背景的影響［1］。對于這些參數(shù)的測定，已經開展了大量的工作［2-5］。這些工作促進了動物品系，特別是新模型動物的推廣和使用。

本文所研究的模型動物為C57-ras，是作者單位通過轉基因的方法，將人原癌基因C-Ha-ras（簡稱ras基因）導入C57小鼠基因組中而自主建立（專利公開號：CN 101532018A）。該模型將主要用于藥物臨床前安全性評價、抗癌藥物的篩選等領域，以部分替代傳統(tǒng)的耗時長、費用高的2年期大小鼠致癌性評價方法［6］。本實驗背景數(shù)據的獲得，將為該模型的在致癌性安全評價中的使用提供支持，同時也豐富了國家嚙齒類實驗動物種子中心的背景數(shù)據庫，可更好的為公眾服務。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

從人基因組中分離獲得人原癌基因c-Ha-ras，經純化處理，顯微注射受精卵細胞，經移植產仔篩選，獲得6只C57-ras首建鼠。將首建鼠與健康普通C57小鼠交配建系傳代動物，有3只成功建系［SCXK（京）2005-0004］。本次實驗所用動物為F5-6代，飼養(yǎng)于本單位實驗動物資源中心的清潔級環(huán)境，飼喂SPF小鼠顆粒飼料，飲用自來水。

通過PCR方法檢測篩選動物。引物設計針對轉基因的編碼序列，序列為：上游引物為Pri.PFT：5’-acacgggccgtagctgagtcgagagct-3’，下游引物為Pri.PRN1735：ctgcggtcagcagcctcccttgtgcc。PCR體系按常規(guī)方法建立。

分組：分為ras陰性雌鼠（ras-）、ras陰性雄鼠（ras-）、ras陽性雌鼠（ras+）、ras陽性雄鼠（ras+）等4組，各組5只動物。

1.2 測試儀器及試劑

日本光電MEK 27222K血球分析儀測定血液生理指標，儀器精度：WBC 210％，RBC 115％，HGB 115％，MCV 110％，PLT 410％。分析試劑是溶血劑ⅠDH680，批號20091207；溶血劑ⅡDH910，批號20091201。

OlympusAU400全自動生化分析儀測定血液生化指標，所用生化試劑批號090381.200911，生產公司是中生北控生物科技股份有限公司。

sartorius BS110S電子天平測定臟器重量，精度是0.1mg，德國塞多利斯公司生產。

1.3 采血方法

空腹12h，活體稱重后，眼眶靜脈叢采血，用于血液生理指標的測定。摘眼球采血，用于血液生化指標的測定，最后小鼠頸椎脫臼處死后解剖。

1.4 血液生理指標測定項目及方法［7］

紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞分布寬度（RDW）、白細胞計數(shù)（WBC）、白細胞分類計數(shù)、血小板計數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）和血小板分布寬度（PDW），共22項。

1.5 血液生化指標測定項目及方法［7］

丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素（BUN）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、鈣（CA）、磷（P）、總膽固醇（CHO）和甘油三酯（TG）。

1.6 臟器指標測定［8］

分離心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、睪丸，用生理鹽水清洗血污，吸水紙吸干表面水分，剔除臟器表面脂肪、筋膜后用電子天平稱重，精確到0.0001g。臟器重量以g為單位，臟器系數(shù)以臟器重量/體重×100％表示。

1.7 數(shù)據處理

用Excel統(tǒng)計實驗所得數(shù)據的均值和方差，進行t檢驗數(shù)據處理，統(tǒng)計結果以平均值±標準差表示。

2 結果

經提取DNA，兩次重復PCR，電泳檢測等實驗對動物進行檢測。兩次重復，均為陽性的判為陽性結果，均為陰性的判為陰性；如果存在結果不一致的情況，重復第三次。將轉基因陽性（ras+）和陰性的（ras-）小鼠隨機分組，進行檢測。通過檢測和篩選，獲得了20只轉基因陽性和陰性動物，用于各種參數(shù)測定。

2.1 血液生理學指標測定結果

測定了22項血液生理學指標，詳見表1［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，嗜中性粒細胞（NEUT）、嗜中性粒細胞百分比（NEUT％）差異顯著（P＜0.05），血小板壓積（PCT）差異極顯著（P＜0.01）；其余19項無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 C57-ras轉基因小鼠和非轉基因小鼠的血液生理參數(shù)Tab.1 Blood physiological values of C57-ras transgenic and non-transgenic mice

ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，紅細胞數(shù)（RBC）、紅細胞壓積（HCT）、血小板數(shù)（PLT）、血小板壓積（PCT）差異顯著（P＜0.05），單核細胞百分比（MON％）差異極顯著（P＜0.01）；其余17項無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 血液生化指標測定結果

共測定了12項血液生化指標，詳見表2［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，12項生化指標均差異不顯著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、甘油三酯（TG）差異顯著（P＜0.05），其余10項差異不顯著（P＞0.05）。

表2 C57-ras轉基因小鼠和非轉基因小鼠的血液生化參數(shù)值Tab.2 Serum biochemical values of C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

2.3 臟器重量和臟器系數(shù)比較

ras-雌鼠和ras+雌鼠、ras-雄鼠和ras+雄鼠的體重分別是19.46±0.65g和20.31±4.05g、26.66±2.69g和26.17±1.21g，其主要臟器重量及系數(shù)見表3［4］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，肺重量差異極顯著（P＜0.01），其余7個臟器重量及系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，8個主要臟器的重量和系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 C57-ras模型在安全評價中應用

根據歐洲經濟合作與發(fā)展組織指導原則（OECD TG 451）規(guī)定，傳統(tǒng)的致癌性評價方法是通過2年期大、小鼠致癌性實驗完成的［6］。這類實驗動物用量大、人力和資金成本高、耗時長，受到背景腫瘤的嚴重干擾，結果準確性差［9］。轉基因或基因敲除的遺傳修飾動物模型的建立，較好的解決了上述問題。在國外，致癌性模型動物已經實現(xiàn)模型動物商品化供應。C57-ras致癌性模型的建立，有望彌補我國新藥評價技術體系中部分缺憾。

表3 C57-ras轉基因小鼠和非轉基因小鼠的臟器重量及系數(shù)比較Tab.3 Comparison of organ weight and coefficient between C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

3.2 部分血液生理生化參數(shù)存在差異

血液生理生化值反映了動物的新陳代謝及生理機能狀況，是衡量動物健康標準及遺傳穩(wěn)定的指標，也是臨床疾病診斷的重要依據。本次實驗結果顯示，組間部分血液、生化參數(shù)存在在差異。如ras+和ras-的NEUT、PCT和RBC之間存在差異；生化參數(shù)ALT和TG存在顯著差異。由于所有動物均在相同條件下飼養(yǎng)，周齡相同；二者差別體現(xiàn)在是否含有轉基因上，即遺傳背景不同。可以推測，該差異可能是由于轉基因的插入，引起動物部分生理生化指標改變。

3.3 臟器重量和臟器系數(shù)幾乎無差異

臟器重量及臟器系數(shù)是衡量動物功能狀態(tài)的重要指標，也是藥物進行毒性實驗的指定檢測項目［11］。從表3可知，ras-雌鼠和ras+雌鼠進行比較，肺重量有極顯著性差異（P＜0.01），其余7個臟器重量及系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。對ras-雄鼠和ras+雄鼠進行比較，8個主要臟器的重量和系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。這進一步證實了rasH2轉基因小鼠和其對照的正常小鼠在其一致的時期主要生物學特性較為一致。

總體而言，轉基因陽性動物和同窩轉基因陰性動物相比較，其血液生理生化、臟器和臟器系數(shù)相差不大。這對該模型將來在臨床前安全評價中應用將是有利的。

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