Cramp轉基因小鼠的構建及鑒定

石桂英，全雄志，陳顯達，陳陟陽，董 偉，張連峰，鞠振宇

（中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，北京 100021）

Cramp（cathelin-related antimicrobial peptide）基因，位于9號染色體，其編碼蛋白為cathelin-related antimicrobial peptide，即cathelicidin。該類蛋白是在哺乳動物體內發現的一類結構多變的抗微生物肽，因在表達的信號肽與成熟肽之間含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族［1］。Cathelicidin是宿主免疫防御系統的重要組成部分。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，還具有抑制組織損傷、促進創傷修復、結合內毒素、誘導血管生成等多種生物學功能。Jiang等［2］研究發現，Cramp在衰老的組織和器官中高表達，并與肝硬化等慢性病相關。為深入研究Cramp在衰老中的作用及機制，我們構建了Cramp轉基因小鼠。

1 材料和方法

1.1 Cramp表達載體及轉基因小鼠的構建

將Cramp cDNA重組到pcDNA3.1+載體中，用Sac I（寶生物工程有限公司）酶切線性化載體，調整濃度為5ng/μL。用顯微注射法將上述線性化片段注射入BDF1小鼠受精卵內，用ICR小鼠做假孕受體［小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所康藍公司，XCXK（京）2004-001］，制備轉基因小鼠。實驗中設計動物的操作程序已經得到中國醫學科學院實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為GC05004。

1.2 PCR方法鑒定Cramp轉基因小鼠的基因型

用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。PCR上游引物為5′GGCTGTGGCGGTCACTATC 3′，下游引物為5′TCACCACCCCCTGTTCCTT 3′，引物由上海生物工程技術有限公司合成。PCR反應體系20μL（試劑購自寶生物工程有限公司）。反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸10min。目的片段長度為276bp。

1.3 RT-PCR檢測Cramp基因表達

取2～3月齡F1代Cramp轉基因陽性及同窩陰性小鼠，Trizol提取小鼠骨髓總RNA，用反轉錄試劑盒（Ferments）反轉錄成cDNA，RT-PCR檢測Cramp基因表達水平。引物同1.2，產物長度276bp。用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease（GAPDH）基因做內參，用FAM標記的Taqman探針監測內參，用SYBR GREEN監測目的基因。Taqman探針為ABI公司生產。

1.4 Western blotting檢測Cramp蛋白表達

取2～3月齡F1代Cramp轉基因陽性及同窩陰性小鼠的肝臟，液氮速凍，切割組織5mg，加入蛋白裂解液600μL，超聲破碎組織30s，間隔10s，至組織完全破碎，加入6×蛋白上樣緩沖液，沸水煮10min，分裝后，凍存于-80℃，備用。肝臟總蛋白進行SDS-PAGE梯度膠電泳（4％～12％聚丙烯酰胺梯度凝膠購自百事創新公司），蛋白轉移到NC膜上（Millipore），用5％BSA封閉。一抗（Santa Cruz公司生產）為兔抗鼠Cramp，二抗（購自中杉金橋公司）為HRP標記羊抗兔。HRP標記的鼠抗β-actin（購自中杉金橋公司）為內參。曝光液為Thermo公司生產。

2 結果

2.1 重組質粒Cramp-pcDNA3.1+的鑒定

圖1 重組質粒酶切鑒定Fig.1 Electrophoretic identification of recombinant plasmid with restriction enzyme digestion

將重組質粒Cramp-pcDNA3.1+分別用NotⅠ、HindⅢ進行酶切電泳后得到544bp的小片段，與預期大小一致，且連接方向正確，將此重組質粒送上海生工生物技術有限公司進行序列分析，確認Cramp-pcDNA3.1+序列正確（圖1）。

2.2 Cramp轉基因小鼠的獲得及F0代轉基因小鼠基因型鑒定

將Cramp-pcDNA3.1+用SacⅠ酶切后回收純化的片段顯微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射受精卵344枚，成活275枚，將存活的受精卵移植到10只假母，共產子鼠75只，鼠尾DNA鑒定陽性14只，即為F0代。部分鑒定結果見圖2。

圖2 部分F0代小鼠鑒定結果Fig.2 PCR analysis of some of F0 generation mice

2.3 RT-PCR檢測Cramp基因表達結果

每個founder取2只PCR鑒定陽性小鼠，提RNA后反轉錄，經實RT-PCR檢測，有5個founder為高表達的，分別為L-2、4、9、10、13、14。部分結果見圖3。

圖3 RT-PCR結果Fig.3 RT-PCR results

2.4 Western blotting檢測Cramp蛋白表達結果

每個Founder取2只PCR鑒定陽性小鼠，取肝臟組織提起蛋白樣品，Western blotting鑒定3個品系為高表達品系，L-3、13、14，部分結果見圖4。

圖4 Western blotting結果Fig.4 Identification of Cramp protein by Western blotting

3 討論

本研究，成功構建了Cramp cDNA載體，用顯微注射法建立了Cramp轉基因小鼠，獲得14只F0代轉基因小鼠，將這些小鼠與C57野生型小鼠交配，產生F1代轉基因小鼠。通過對F1代小鼠進行RTPCR和Western blotting鑒定，篩選出3個高表達轉基因小鼠品系。從RT-PCR和Western blotting結果可以看到，轉基因小鼠Cramp的表達量明顯高于陰性對照小鼠，我們可以應用此轉基因小鼠模型研究Cramp的功能及作用機制。目前對Cramp的研究多集中于其抗菌作用［3-5］，Jiang等［2］研究發現，Cramp蛋白在衰老的組織和器官中高表達，但其在衰老中的作用及機制尚需深入研究。我們構建的Cramp轉基因小鼠為這方面研究提供了動物模型。

［1］Gallo RL，Kim KJ，BernfieldM，etal.Identification of CRAMP，a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse［J］.J Biol Chem，1997，272：13088-13093.

［2］Jiang H，Schiffer E，Song Z，et al.Proteins induced by telomere dysfunction and DNA damage represent biomarkers of human aging and disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：11299-11304.

［3］Kang SW，Lee DG，Yang ST，et al.CRAMP analog having potent antibiotic activity without hemolytic activity［J］.Protein Pept Lett，2002，9：275-282.

［4］Kirikae T，Hirata M，Yamasu H，et al.Protective effects of a human 18-kilodalton cationic antimicrobial protein（CAP18）-derived peptide against murine endotoxemia［J］.Infect Immun，1998，66：1861-1868.

［5］Murakami M，Ohtake T，Dorschner RA，et al.Cathelicidin antimicrobial peptides are expressed in salivary glands and saliva［J］.J Dent Res，2002，81：845-850.