N-甲基亞硝基脲誘導小鼠胸腺淋巴瘤TCR基因重排分析

黃榕芳，余英豪，李 博

（1.南京軍區福州總醫院病理科，福州 350025；2.南京軍區福州總醫院實驗科，福州 350025）

自20世紀80年代末分子生物學技術被應用于淋巴瘤研究以來，分子生物學和分子細胞遺傳學特征已成為非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）診斷和研究中不可缺少的部分［1］。PCR是目前最常用于檢測人類T-NHL克隆性T細胞受體（T-cell receptor，TCR）重排的方法，技術上相對成熟［2，3］。采用N-甲基亞硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）腹腔分次注射的方法，本實驗室成功誘導了67.5％（27/40）實驗組小鼠產生胸腺淋巴瘤［4］。光學顯微鏡下胸腺結構破壞，代之以彌漫分布的中等大小的淋巴樣腫瘤細胞。免疫組織化學瘤細胞表達CD3和TdT。形態學和免疫組織化學結果證實27例胸腺腫瘤均為T淋巴母細胞淋巴瘤［5］。本部分以TCRβ和TCRγ基因重排為分子標志，應用高靈敏度的巢式PCR技術，對MNU誘導的小鼠胸腺T細胞淋巴瘤形成過程中發生的單克隆性基因重排變化進行探究性檢測，旨在組織病理和免疫分型的基礎上進一步確定MNU誘導腫瘤是否屬T細胞克隆性增生。

1 材料和方法

1.1 標本采取

選用6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠52只［SCXK（滬）2003-0003］，隨機分為實驗組40只和對照組12只。實驗組于第0、8周分次腹腔注射MNU誘導液（50mg/kg體重）；對照組腹腔注射等量生理鹽水。第22周所有小鼠頸椎脫位法處死。采集實驗組胸腺淋巴瘤組織8例和對照組胸腺組織4例，迅速放入液氮罐內，后置入-70℃冰箱凍存。

1.2 基因組DNA提取

使用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒（Takara公司），按說明書提取DNA，并用紫外分光光度儀和1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取DNA質量。

1.3 巢式PCR

1.3.1 引物設計：引物設計參照文獻［6］（表1）。

表1 PCR擴增和測序引物Tab.1 Oligonucleotide sequences for primers used in PCR assays and DNA sequence analysis

1.3.2 PCR擴增：50μL反應體系，含10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture 0.2mmol、引物各0.02μmol、模板DNA 200ng、Ex Taq酶2.5U（Takara公司）。經30個循環，循環開始前95℃預變性4min，循環結束后72℃延伸10min，然后保持在10℃。每一循環由變性95℃/15s、退火/15s（表1）和延伸72℃/30s三相組成。第一輪以提取的基因組DNA為模板，選用外側引物；第二輪以第一輪擴增產物為模板，選用內側引物。每次擴增均設立無DNA模板的空白陰性對照。

1.3.3 PCR產物檢測：取PCR擴增產物行1.5％瓊脂糖凝膠（含溴化乙啶）電泳，紫外透射分析儀上判讀結果。

1.3.4 結果判定標準：與標準DNA分子量（Fermentas公司）對照，出現1～2條清晰、不連續的電泳條帶為TCR陽性。3條以上、涂抹狀散發性條帶（smear）或無特異性條帶者為陰性。

1.4 PCR產物膠回收及測序

TCRγ PCR產物按常規在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，用DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），按說明書操作回收DNA，委托Invitrogen公司測定序列。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增

8例胸腺淋巴瘤巢式PCR均顯示TCRβ、TCRγ單克隆性重排，兩步反應陽性結果均呈現單一特異性條帶。TCRβ基因第一輪擴增產物大小約為331bp，第二輪擴增基因重排帶位于190～242bp范圍內。TCRγ基因第一輪擴增帶片段大小約242～331bp，第二輪片段大小約190～242bp。對照組胸腺組織和空白陰性對照二次擴增均未出現特異性條帶（圖1～圖4）。

2.2 DNA序列分析

TCRγ基因內側引物的PCR產物片段正反向序列分析結果顯示，8例TCRγ基因的PCR陽性標本（產物1至產物8）分別為199～207bp不等的尖銳單峰。8例均含TCRGV3S1/TCRGJ1基因連接區、TCRGV3S1及TCRGJ1序列。表2所示為PCR產物1至產物8的TCRGV3S1/TCRGJ1基因重排區域片段與TCRγ胚系基因序列比對結果，其中V、J連接區插入核苷酸序列0～7bp大小。

圖1 TCRβ基因重排第一輪擴增結果Fig.1 The primary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

圖2 TCRβ基因重排第二輪擴增結果Fig.2 The secondary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

3 討論

2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類的診斷標準強調，淋巴組織腫瘤應結合形態學、免疫表型、遺傳學以及臨床特點等信息界定每一種疾病實體［8，9］。目前，分子生物學技術已在 NHL的診斷應用上受到較為廣泛的重視，為NHL的傳統診斷方法（組織形態觀察、免疫組織化學）提供了新的技術手段輔助診斷，是對傳統診斷方法的重要補充。

圖3 TCRγ基因重排第一輪擴增結果Fig.3 The primary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

圖4 TCRγ基因重排第二輪擴增結果Fig.4 The secondary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

PCR技術是一種體外酶促合成特異性DNA片段的方法，其分析T-NHL基因重排的原理基于所用引物特異性結合TCR基因的V區和J區。TCR由分隔在胚系基因組染色體上的多個基因編碼，只有當基因發生重排使分隔的V區與J區靠近時，才能得到有效擴增。正常生理狀態下，胸腺組織T淋巴細胞發育過程中，TCR基因結構不斷發生隨機重排，而且V-（D）-J結合區域隨機插入不同數量的堿基形成完整的基因，故使每個T淋巴細胞均具有特異的結構基因，呈多克隆性。其PCR擴增產物片段長短不一，基因序列不同，電泳后表現為染色均勻的彌漫帶（smear）或彌漫片狀多克隆背景上相對較強的單克隆條帶。胸腺T細胞淋巴瘤則為T淋巴細胞某個分化階段發生突變的惡性克隆性增殖所致，瘤細胞為同一基因結構，屬于單克隆性。經PCR擴增后，電泳呈一窄帶。這就是PCR檢測TCR基因重排的分子生物學基礎。本研究對Lista等［6］的研究方法作了相應改進，選用單純的巢式PCR擴增和電泳技術鑒定小鼠淋巴瘤的克隆性質。實驗過程采用兩組不同的V區引物和J區引物進行兩步反應，一方面提高了靈敏度和檢出率，另一方面也增加了反應的特異性。

表2 TCRγ基因重排V-J結合區DNA序列Tab.2 DNA sequence of TCRγ rearrangement VJ junctions

用PCR方法分析淋巴增生性疾病的TCR基因重排的研究，以前主要集中在TCRβ基因的V、D、J片段上。由于小鼠TCRβ鏈（6號染色體）V區片段眾多，有20個基因片段［10］，通用引物可能降低檢測的陽性率，家族特異性引物因引物數量太多而操作復雜。本研究引用的TCRBV5S1/TCRBJ2引物僅覆蓋1個V區基因片段，可能僅能識別胸腺組織的小部分TCRBVJ重排［6］。然而，位于13號染色體上的TCRγ基因重排發生在T細胞分化的早期，參與重排的片段數量相對有限，僅含有7個V區、4個J區和4個C區基因片段［11］，其引物可能擴增出TCRγ基因所有V-J重排。另據報道，人類基因水平的TCRγ V-J基因重排出現在幾乎所有的T細胞淋巴瘤及T淋巴細胞中［12］。基于以上考慮，我們聯合選用針對TCRβ和TCRγ的巢式引物，以增強特異性，提高檢出率。

本實驗使用的模板DNA來自實驗動物體內的原發性腫瘤，而非經過培養的細胞系，故能真實反映淋巴瘤在體內的惡性轉化過程。研究結果顯示，在確診的8例胸腺淋巴瘤中全部檢出TCRβ和TCRγ克隆性基因重排，陽性率均為100％。二者第二輪擴增帶片段大小近似，均位于190～242bp范圍內。4例對照組胸腺組織DNA中無一例出現陽性條帶。不同處理組檢出陽性率差異有顯著意義，說明TCRβ和TCRγ基因重排在小鼠胸腺T細胞淋巴瘤中具有很高的發生頻率，對其克隆性和細胞源性的確定有重要價值。實驗中未出現假陽性或假陰性結果，分析主要原因是巢式PCR方法的高度特異性；另一方面加樣量、PCR反應條件、電泳條件等各項實驗條件的優化，也可能有效避免了假陽性或假陰性結果的出現。

送檢的8例TCRγ重排PCR產物均得到了測序結果。將測序結果與TCRγ胚系基因［6，7］作比較，分別得出TCRGV3S1/TCRGJ1基因連接區、TCRGV3S1及TCRGJ1序列，驗證了擴增產物即為TCRγ基因V區與J區的克隆性重排片段。8例基因重排連接區為0～7bp大小不等片段。片段大小的差異，考慮與每一例13號染色體上V區和J區的斷裂點不同和所插入的N-區域核苷酸序列的多少有關［13］，這同時也解釋了8例DNA序列并不完全相同的原因。雖然我們未對第一輪擴增產物作DNA序列測定，但第二輪反應產物片段（190～242bp）略小于第一輪（242～331bp）符合理論推算，也間接說明了結果的可靠性。

本研究有力說明了所使用的TCRβ、TCRγ基因巢式引物對胸腺T細胞淋巴瘤的克隆性和細胞源性的確定是相當敏感而特異的，結合形態學和免疫組織化學結果［5］，再次證實MNU誘導的小鼠胸腺淋巴瘤的形成過程實際上是單個T淋巴細胞TCR基因重排后，在MNU的作用下發生惡性轉化，并單克隆性增生，最終取代胸腺內正常細胞，是屬于T細胞來源的腫瘤。

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