A（H1N1）疫苗免疫的血清中和抗體的交叉免疫反應(yīng)分析

占玲俊，鮑琳琳，蔣 虹，叢 哲，金 光，鄧 巍，許黎黎，孫惠惠，朱 華，張連峰，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021）

A（H1N1）流感病毒的基因整合來自北美和歐洲的豬體內(nèi)的流感病毒基因，而這些基因之前并沒有在豬或者人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)（新型豬源性流感病毒），即出現(xiàn)了能感染人的新型豬源性A型流感病毒［1，2］。A（H1N1）流感在全球迅速發(fā)展，此次流感發(fā)病急，部分病例病程進(jìn)展迅速，而臨床上有沒有特效的抗病毒藥，因此，流感的預(yù)防顯得尤為重要，其中接種疫苗是預(yù)防甲型H1N1流感流行的有效手段之一。

前期的臨床試驗(yàn)證明A（H1N1）疫苗能對人群產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，并且疫苗的安全性良好。但是接種甲型H1N1疫苗后，機(jī)體對病毒入侵的抵抗和保護(hù)情況到底如何，尚且需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢測來判定。

另外，面對嚴(yán)峻的疫情，有限量的疫苗很難滿足大量人群的接種需求，現(xiàn)有的季節(jié)性疫苗能否對A（H1N1）產(chǎn)生免疫保護(hù)，面對A（H1N1）和季節(jié)性流感病毒的混合感染，人群是采用一針免疫還是兩針免疫，這些尚需進(jìn)一步的探討。

流感病毒感染機(jī)體時(shí)，機(jī)體通過非特異性免疫和特異性免疫與病毒抗衡。在流感病毒的免疫防疫機(jī)制中，起保護(hù)作用的中和抗體血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體具有重要的意義，這也是病毒疫苗的研究中常常以中和抗體作為特異性指標(biāo)的原因。若流感病毒抗原發(fā)生變異，機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可能由于病毒的變異而逐漸失去其保護(hù)作用［3-5］。

而檢測中和抗體的常用方法是病毒中和實(shí)驗(yàn)，如果血清能中和流感病毒，則不能引起MDCK細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變（CPE），反之則發(fā)生病變，由此通過判斷細(xì)胞病變間接反映血清中的抗體水平。

通過檢測血清中的中和抗體的效價(jià)可以判斷疫苗的免疫效果，另外通過觀察免疫血清與不同亞型病毒的免疫反應(yīng)情況可以判斷是否存在交叉免疫，如果存在交叉免疫，則感染不同亞型流感病毒的人群可以通用某一種流感疫苗，或者混合感染不同亞型流感病毒的人群只需要接種一種疫苗，對流感病毒的防控有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞和毒株：MDCK在加入10％胎牛血清（Invitrogen）的DMEM完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h傳代一次。A/California/7/2009 H1N1，A/Brisbane/10/2007 H3N2，A/Brisbane/59/2007 H1N1和A/Shenzhen/406H/2006 H5N1接種在10日齡的雞胚中，放37℃孵箱中生長，48h后收獲H1N1（CA7），H3N2（Brisbane）和H1N1（Brisbane）毒液，24h后收獲H5N1（SZ）毒液，毒種放-80℃儲(chǔ)存。擴(kuò)增病毒的所有操作均在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 血清

接種2009年新型甲型H1N1疫苗的人血清30份來自本所接種過該疫苗的志愿者；陰性血清10份來自本所未接種該疫苗的正常志愿者。H1N1（CA7）和H3N2（Brisbane）陽性血清對照由本所保存。血清放-20℃保存，使用時(shí)拿出。

1.3 方法

1.3.1 血清滅活和稀釋：將陽性對照血清、10份未免疫過的血清和30份免疫血清放在56℃水浴鍋中滅活30min。之后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將待檢血清、H1N1（CA7）陽性血清和H3N2（Brisbane）陽性血清用維持液稀釋至1∶40和1∶400。

1.3.2 稀釋病毒：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將H1N1（CA7）、H3N2（Brisbane）、H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）稀釋為100TCID50，取50μL病毒加入到孔內(nèi)。

1.3.3 中和病毒：取稀釋好的血清50μL/每孔分別與50μL的H1N1（CA7）、H3N2（Brisbane）、H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）等量混合，37℃孵育1.5h。將作用好的含病毒-血清混合物的微量培養(yǎng)板移入到生物安全柜內(nèi)。同時(shí)將MDCK細(xì)胞稀釋成1.5×105/mL，其稀釋液用細(xì)胞生長液，各孔加100μL，細(xì)胞對照各孔加100μL細(xì)胞生長液和100μL細(xì)胞懸液。另外設(shè)有血清對照和病毒對照。置35℃ 5％CO2孵箱內(nèi)孵育48h。經(jīng)2d培養(yǎng)觀察CPE，同時(shí)吸取上清每孔50μL，加入1％火雞血50μL，混勻，靜置30min進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)。

2 結(jié)果

1∶40和1∶400滴度的H1N1（CA7）陽性血清與H1N1（CA7）發(fā)生中和反應(yīng)后CPE結(jié)果陰性，而1∶40滴度的H3N2（Brisbane）陽性血清與H3N2（Brisbane）反應(yīng)后，CPE反應(yīng)陰性，但稀釋度為1∶400時(shí)CPE陽性。僅僅只有陰性血清本身不能引起CPE（表1）。

血清滴度為1∶40時(shí)，30份接種A（H1N1）疫苗的免疫血清與病毒H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）反應(yīng)后，CPE結(jié)果陰性；而當(dāng)血清滴度為1∶400時(shí)，依次有13份，20份，21份血清與病毒反應(yīng)后CPE結(jié)果陰性，而相應(yīng)的有11份，6份，3份血清CPE陽性，分別有6份，4份，6份血清出現(xiàn)CPE可疑結(jié)果。血清滴度為1∶40和1∶400時(shí)，30份免疫血清與H5N1病毒反應(yīng)后，H5N1均為CPE陽性。

表1 陽性和陰性對照的CPE結(jié)果Tab.1 CPE results of positive and negative controls

未免疫過的10份對照血清稀釋度為1∶40時(shí)，與上述4種病毒反應(yīng)后分別有10，10，4，0份血清CPE結(jié)果陰性，0，0，6，10份CPE陽性；1∶400稀釋時(shí)，相應(yīng)的依次有8，7，0，0份CPE結(jié)果陰性，2，2，9，10份CPE陽性，與H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）各有1份不定陽性結(jié)果。分析表2的數(shù)據(jù)，1∶40的未免疫和免疫后血清的中和反應(yīng)陽性率的相關(guān)系數(shù)0.8165，1∶400的未免疫和免疫后血清的中和反應(yīng)陽性率的相關(guān)系數(shù)-0.6744（表2）。

表2 統(tǒng)計(jì)兩種稀釋度的免疫和未免疫血清的中和保護(hù)率Tab.2 Percentage of positive neutralization reac tion for vaccinated and unvaccinated serum

3 討論

本研究利用病毒中和實(shí)驗(yàn)，將定量的病毒與不同稀釋度的血清相結(jié)合，作用后接種細(xì)胞，以測定血清中中和抗體的效價(jià)。并通過復(fù)核實(shí)驗(yàn)確定CPE不是由于血清毒性引起而是病毒引起的。

稀釋度為1∶40和1∶400的未免疫和免疫血清均能與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）發(fā)生免疫反應(yīng)，但是未免疫血清不能與H1N1（CA7）發(fā)生免疫反應(yīng)說明人群曾經(jīng)感染過H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane），小部分人群可能感染過H1N1（CA7），但均未感染過H5N1。

分析30份免疫血清和10份未免疫的對照血清的CPE結(jié)果的相關(guān)性，根據(jù)線性方程，血清稀釋度為1∶40時(shí)，未免疫和免疫的血清中和反應(yīng)陽性率的相關(guān)系數(shù)0.8165，該相關(guān)系數(shù)說明免疫后的血清與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）的中和反應(yīng)有增強(qiáng)的趨勢；血清稀釋度為1∶400時(shí)，相關(guān)系數(shù)-0.6744說明疫苗對血清中和反應(yīng)有影響。綜合上述結(jié)果可以看出：1.疫苗免疫對人群的免疫力有提高；2.A（H1N1）疫苗不能提高H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H5N1的免疫水平，提示新型甲流疫苗不能與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）產(chǎn)生交叉免疫。

當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)檢測的免疫血清只有30份，樣本的涵蓋面有限，而且不同地區(qū)，不同年齡的人群的免疫情況可能存在差異，所以免疫效果的評價(jià)不能完全反映疫苗對人群的保護(hù)情況，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該加大樣本量。10份未免疫血清對CA7 H1N1，H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）產(chǎn)生中和保護(hù)作用，甚至比免疫血清的保護(hù)率高，這可能跟未免疫血清和免疫血清的人群的地區(qū)來源，人群的年齡，病毒接觸史不同有關(guān)。另外未免疫血清和免疫血清對H5N1（SZ）均沒有中和保護(hù)作用，這也可以排除血清的非特異作用。雖然未免疫血清和免疫血清對CA7 H1N1，H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）的中和保護(hù)作用不明顯，但是，隨著血清的稀釋度增加到1∶400，免疫血清的保護(hù)作用逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)于未免疫血清，逐漸顯現(xiàn)出疫苗的免疫保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)血清的稀釋度設(shè)立了1∶40和1∶400，我們知道，血清抗體效價(jià)≥1∶40時(shí)，在免疫學(xué)上才有意義，而另外通過設(shè)立1∶400的稀釋度篩查人群中的中和抗體的水平，以及在此稀釋度下是否存在交叉免疫。當(dāng)然，如果想全面了解人群中的抗體水平，還應(yīng)該在1∶40和1∶400之間設(shè)立多個(gè)稀釋度梯度。

通過檢測未免疫血清中抗體產(chǎn)生情況，可以了解人群是否感染過流感病毒，檢測免疫血清的中和抗體，可以判斷A（H1N1）疫苗的免疫效果，為疫苗接種提供參考指標(biāo)。另外，通過檢測血清與不同亞型流感病毒是否有交叉免疫反應(yīng)，可以為多種流感病毒感染時(shí)疫苗接種提供新的線索［3，5-7］。

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